БИОХИМИЯ, 2023, том 88, вып. 9, с. 1606–1619
УДК 577.24
Влияние расположения и ориентации генетического токсин-антитоксинового элемента hok/sok на уровень биосинтеза фармацевтически значимых белков в бактериальной системе экспрессии
1 ФИЦ Биотехнологии РАН, Институт биоинженерии, 117312 Москва, Россия
Поступила в редакцию 20.04.2023
После доработки 15.08.2023
Принята к публикации 15.08.2023
DOI: 10.31857/S0320972523090129
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: гетерологичная экспрессия рекомбинантных белков, системы токсин-антитоксин, аспарагиназа, нуклеопротеин, соматотропин.
Аннотация
Генетический токсин-антитоксиновый элемент hok/sok из плазмиды R1 Escherichia coli обеспечивает сегрегационную стабильность плазмид. Бактериальные клетки, потерявшие все копии плазмиды, кодирующей короткоживущий антитоксин, гибнут под действием долгоживущего токсина. Элемент hok/sok в составе векторных плазмид для бактериальной экспрессии может увеличивать продуктивное время биосинтеза рекомбинантных белков, замедляя накопление в популяции непродуцирующих клеток, лишенных целевой плазмиды. В настоящей работе были исследованы различные варианты расположения и ориентации элемента hok/sok в составе стандартной плазмиды pET28a с индуцибельным промотором T7lac и геном устойчивости к канамицину. Было обнаружено, что элемент hok/sok сохраняет функциональную активность вне зависимости от расположения на плазмиде и ориентации, бактериальные клетки сохраняли плазмиды с hok/sok после 4‑х дней культивирования без антибиотика и теряли контрольную плазмиду без данного элемента. На примере трех целевых белков – аспаргиназы E. coli тип II, гормона роста человека и нуклеопротеина вируса SARS‑CoV‑2 было продемонстрировано, что для цитоплазматических целевых белков максимальная продуктивность бактерий сохраняется только при расположении элемента hok/sok на плазмиде выше промотора целевого гена. В случае периплазматической локализации белка продуктивность бактерий уменьшается для всех вариантов расположения hok/sok при культивировании с антибиотиком, а при периодическом культивировании бактерий без антибиотика продуктивность лучше сохраняется также при расположении элемента hok/sok выше промотора целевого гена. Данный вариант векторной плазмиды pEHU позволяет увеличить биосинтез нерастворимого в цитоплазме бактерий гормона роста человека более, чем в 2 раза при культивировании бактерий без антибиотика, а также поддерживать биосинтез аспарагиназы при периодическом культивировании без антибиотика в течение 4‑х дней на уровне не менее 10 мг/литр. Разработанный сегрегационно стабилизированный плазмидный вектор может быть использован для получения в клетках E. coli различных рекомбинантных белков без применения антибиотиков.
Текст статьи
Сноски
* Адресат для корреспонденции.
Финансирование
Работа выполнена в рамках госзадания ФИЦ Биотехнологии РАН.
Благодарности
Л.А. Усакину, В.О. Шендер (ИБХ РАН); А.А. Пискаревой (МГУ имени Ломоносова).
Вклад авторов
И.И. Воробьев – концепция и руководство работой; Н.А. Орлова, Ю.А. Ходак, Р.Р. Шайфутдинов, Д.С. Хасанов – проведение экспериментов; И.И. Воробьев, Н.А. Орлова, Ю.А. Ходак – обсуждение результатов исследования; И.И. Воробьев, Н.А. Орлова – написание текста; Ю.А. Ходак – редактирование текста статьи.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Соблюдение этических норм
Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.
Дополнительные материалы
Приложение 1
Приложение 2
Приложение 3
Приложение 4
Приложение 5
Приложение 6
Приложение 7
Список литературы
1. Collins, T., Azevedo-Silva, J., da Costa, A., Branca, F., Machado, R., and Casal, M. (2013) Batch production of a silk-elastin-like protein in E. coli BL21(DE3): key parameters for optimisation, Microb. Cell Fact., 12, 21, doi: 10.1186/1475-2859-12-21.
2. Pandey, D. P., and Gerdes, K. (2005) Toxin–antitoxin loci are highly abundant in free-living but lost from host-associated prokaryotes, Nucleic Acids Res., 33, 966-976, doi: 10.1093/nar/gki201.
3. Gerdes, K., Rasmussen, P. B., and Molin, S. (1986) Unique type of plasmid maintenance function: postsegregational killing of plasmid-free cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 3116-3120, doi: 10.1073/pnas.83.10.3116.
4. Lehnherr, H., Maguin, E., Jafri, S., and Yarmolinsky, M. B. (1993) Plasmid addiction genes of bacteriophage P1: doc, which causes cell death on curing of prophage, and phd, which prevents host death when prophage is retained, J. Mol. Biol., 233, 414-428, doi: 10.1006/jmbi.1993.1521.
5. Singh, G., Yadav, M., Ghosh, C., and Rathore, J. S. (2021) Bacterial toxin-antitoxin modules: classification, functions, and association with persistence, Curr. Res. Microb. Sci., 2, 100047, doi: 10.1016/j.crmicr.2021.100047.
6. Van Melderen, L., Thi, M. H., Lecchi, P., Gottesman, S., Couturier, M., and Maurizi, M. R. (1996) ATP-dependent degradation of CcdA by Lon protease. Effects of secondary structure and heterologous subunit interactions, J. Biol. Chem., 271, 27730-27738, doi: 10.1074/jbc.271.44.27730.
7. Michel, B. (2005) After 30 years of study, the bacterial SOS response still surprises us, PLoS Biol., 3, e255, doi: 10.1371/journal.pbio.0030255.
8. Fineran, P. C., Blower, T. R., Foulds, I. J., Humphreys, D. P., Lilley, K. S., and Salmond, G. P. (2009) The phage abortive infection system, ToxIN, functions as a protein-RNA toxin-antitoxin pair, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 894-899, doi: 10.1073/pnas.0808832106.
9. Jankevicius, G., Ariza, A., Ahel, M., and Ahel, I. (2016) The toxin-antitoxin system DarTG catalyzes reversible ADP-ribosylation of DNA, Mol. Cell, 64, 1109-1116, doi: 10.1016/j.molcel.2016.11.014.
10. Wang, X., Lord, D. M., Hong, S. H., Peti, W., Benedik, M. J., Page, R., and Wood, T. K. (2013) Type II toxin/antitoxin MqsR/MqsA controls type V toxin/antitoxin GhoT/GhoS, Environ. Microbiol., 15, 1734-1744, doi: 10.1111/1462-2920.12063.
11. Aakre, C. D., Phung, T. N., Huang, D., and Laub, M. T. (2013) A bacterial toxin inhibits DNA replication elongation through a direct interaction with the beta sliding clamp, Mol. Cell, 52, 617-628, doi: 10.1016/j.molcel.2013.10.014.
12. Wang, X., Yao, J., Sun, Y. C., and Wood, T. K. (2021) Type VII toxin/antitoxin classification system for antitoxins that enzymatically neutralize toxins, Trends Microbiol., 29, 388-393, doi: 10.1016/j.tim.2020.12.001.
13. Choi, J. S., Kim, W., Suk, S., Park, H., Bak, G., Yoon, J., and Lee, Y. (2018) The small RNA, SdsR, acts as a novel type of toxin in Escherichia coli, RNA Biol., 15, 1319-1335, doi: 10.1080/15476286.2018.1532252.
14. Gerdes, K., and Maisonneuve, E. (2012) Bacterial persistence and toxin-antitoxin loci, Annu. Rev. Microbiol., 66, 103-123, doi: 10.1146/annurev-micro-092611-150159.
15. Yamaguchi, Y., and Inouye, M. (2011) Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems, Nat. Rev. Microbiol., 9, 779-790, doi: 10.1038/nrmicro2651.
16. Gerdes, K., Larsen, J. E., and Molin, S. (1985) Stable inheritance of plasmid R1 requires two different loci, J. Bacteriol., 161, 292-298, doi: 10.1128/JB.161.1.292-298.1985.
17. Pecota, D. C., Osapay, G., Selsted, M. E., and Wood, T. K. (2003) Antimicrobial properties of the Escherichia coli R1 plasmid host killing peptide, J. Biotechnol., 100, 1-12, doi: 10.1016/s0168-1656(02)00240-7.
18. Gerdes, K. (2016) Hypothesis: type I toxin-antitoxin genes enter the persistence field-a feedback mechanism explaining membrane homoeostasis, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 371, 20160189, doi: 10.1098/rstb.2016.0189.
19. Unterholzner, S. J., Poppenberger, B., and Rozhon, W. (2013) Toxin-antitoxin systems: Biology, identification, and application, Mob. Genet. Elements, 3, e26219, doi: 10.4161/mge.26219.
20. Van Melderen, L. (2010) Toxin-antitoxin systems: why so many, what for? Curr. Opin. Microbiol., 13, 781-785, doi: 10.1016/j.mib.2010.10.006.
21. Pedersen, K., and Gerdes, K. (1999) Multiple hok genes on the chromosome of Escherichia coli, Mol. Microbiol., 32, 1090-1102, doi: 10.1046/j.1365-2958.1999.01431.x.
22. Pedersen, K., Christensen, S. K., and Gerdes, K. (2002) Rapid induction and reversal of a bacteriostatic condition by controlled expression of toxins and antitoxins, Mol. Microbiol., 45, 501-510, doi: 10.1046/j.1365-2958.2002.03027.x.
23. Wilmaerts, D., Dewachter, L., De Loose, P. J., Bollen, C., Verstraeten, N., and Michiels, J. (2019) HokB monomerization and membrane repolarization control persister awakening, Mol. Cell, 75, 1031-1042.e4, doi: 10.1016/j.molcel.2019.06.015.
24. Chukwudi, C. U., and Good, L. (2015) The role of the hok/sok locus in bacterial response to stressful growth conditions, Microb. Pathog., 79, 70-79, doi: 10.1016/j.micpath.2015.01.009.
25. Pecota, D. C., Kim, C. S., Wu, K., Gerdes, K., and Wood, T. K. (1997) Combining the hok/sok, parDE, and pnd postsegregational killer loci to enhance plasmid stability, Appl. Environ. Microbiol., 63, 1917-1924, doi: 10.1128/AEM.63.5.1917-1924.1997.
26. De Moerlooze, L., Struman, I., Renard, A., and Martial, J. A. (1992) Stabilization of T7-promoter-based pARHS expression vectors using the parB locus, Gene, 119, 91-93, doi: 10.1016/0378-1119(92)90070-6.
27. Mishima, N., Mizumoto, K., Iwasaki, Y., Nakano, H., and Yamane, T. (1997) Insertion of stabilizing loci in vectors of T7 RNA polymerase-mediated Escherichia coli expression systems: a case study on the plasmids involving foreign phospholipase D gene, Biotechnol. Prog., 13, 864-868, doi: 10.1021/bp970084o.
28. Galen, J. E., Nair, J., Wang, J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein, M. B., and Levine, M. M. (1999) Optimization of plasmid maintenance in the attenuated live vector vaccine strain Salmonella typhi CVD 908-htrA, Infect. Immun., 67, 6424-6433, doi: 10.1128/IAI.67.12.6424-6433.1999.
29. Morin, C. E., and Kaper, J. B. (2009) Use of stabilized luciferase-expressing plasmids to examine in vivo-induced promoters in the Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR, FEMS Immunol. Med. Microbiol., 57, 69-79, doi: 10.1111/j.1574-695X.2009.00580.x.
30. Kolesov, D. E., Sinegubova, M. V., Safenkova, I. V., Vorobiev, I. I, and Orlova, N. A. (2022) Antigenic properties of the SARS-CoV-2 nucleoprotein are altered by the RNA admixture, PeerJ, 10, e12751, doi: 10.7717/peerj.12751.
31. Gerdes, K., Jacobsen, J. S., and Franch, T. (1997). Plasmid Stabilization by Post-Segregational Killing, in Genetic Engineering (Setlow, J. K., ed), Vol. 19, Springer, Boston, MA, doi: 10.1007/978-1-4615-5925-2_3.
32. Liao, Y. C., Saengsawang, B., Chen, J. W., Zhuo, X. Z., and Li, S. Y. (2022) Construction of an antibiotic-free vector and its application in the metabolic engineering of Escherichia coli for polyhydroxybutyrate production, Front. Bioeng. Biotechnol., 10, 837944, doi: 10.3389/fbioe.2022.837944.
33. Sun, B. Y., Wang, F. Q., Zhao, J., Tao, X. Y., Liu, M., and Wei, D. Z. (2023) Engineering Escherichia coli for l-homoserine production, J. Basic Microbiol., 63, 168-178, doi: 10.1002/jobm.202200488.