Рациональный дизайн одноцепочечного олигодезоксирибонуклеотида, используемого для коррекции мутаций при геномном редактировании

1 Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова, 115522 Москва, Россия

2 Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины Российского национального исследовательского медицинского университета имени Н.И. Пирогова, 117997 Москва, Россия

Поступила в редакцию 03.12.2021
После доработки 19.04.2022
Принята к публикации 19.04.2022

DOI: 10.31857/S0320972522050037

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: CRISPR-Cas9, репарация с помощью однонитевой матрицы, одноцепочечные олигодезоксирибонуклеотиды, EGFP, проточная цитофлуориметрия.

Аннотация

Геномное редактирование позволяет целенаправленно вносить разнообразные изменения в геном, что потенциально может быть использовано для лечения наследственных заболеваний человека. Несмотря на многочисленные исследования в этой области, эффективность методов коррекции мутаций все еще остается невысокой, что не позволяет использовать данные методы в рутинной практике. Показано, что рациональный дизайн компонентов геномного редактирования может существенно повысить эффективность исправления мутаций. В данной работе мы предлагаем дизайн одноцепочечных олигодезоксирибонуклеотидов (оцОДН) для более эффективного редактирования генов. С использованием модельной системы с восстановлением нокаутированного EGFP, интегрированного в геном клеточной культуры HEK293T, показано, что лишь небольшая часть оцОДН (около 20 нуклеотидов – с 14‑го нуклеотида с 5′‑конца от двухцепочечного разрыва до 4‑го нуклеотида в сторону 3′‑конца), используемой в качестве донорной молекулы для репарации двухцепочечного разрыва ДНК, интегрирует в место разрыва. На основе полученных данных можно рационально подходить к дизайну оцОДН для исправления мутаций с помощью метода CRISPR-Cas9 для разработки генной терапии наследственных болезней человека.

Текст статьи

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации для ФГБНУ «МГНЦ». Создание клеточной культуры HEK293T-GFPmut выполнено за счет средств гранта РФФИ № 19-29-04044.

Благодарности

Коллектив выражает благодарность к.б.н. Н.Г. Гурской из Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины Российского национального исследовательского медицинского университета имени Н.И. Пирогова (Москва) за помощь в получении клеточной культуры HEK293T-GFPmut.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Дополнительные материалы

Список литературы

1. Fellmann, C., Gowen, B. G., and Lin, P. C. (2017) Cornerstones of CRISPR-Cas in drug discovery and therapy, Nat Rev Drug Discov., 16, 89-100, doi: 10.1038/nrd.2016.238.

2. Peters-Hall, J. R., Coquelin, M. L., Torres, M. J., LaRanger, R., Alabi, B. R., et al. (2018) Long-term culture and cloning of primary human bronchial basal cells that maintain multipotent differentiation capacity and CFTR channel function, Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 315, L313-L327, doi: 10.1152/ajplung.00355.2017.

3. Smirnikhina, S. A., Kondrateva, E. V., Adilgereeva, E. P., Anuchina, A. A., Zaynitdinova, M. I., et al. (2020) P.F508del editing in cells from cystic fibrosis patients, PLoS One, 15, e0242094, doi: 10.1371/journal.pone.0242094.

4. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., and Corn, J. E. (2016) Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA, Nat. Biotechnol., 34, 339-344, doi: 10.1038/nbt.3481.

5. Guha, T. K., Wai, A., and Hausner, G. (2017) Programmable genome editing tools and their regulation for efficient genome engineering, Comput. Struct. Biotechnol. J., 15, 146-160, doi: 10.1016/j.csbj.2016.12.006.

6. Durai, S., Mani, M., Kandavelou, K., Wu, J., Porteus, W. H., and Chandrasegaran, S. (2005) Zinc finger nucleases: Custom-designed molecular scissors for genome engineering of plant and mammalian cells, Nucleic Acids Res., 33, 5978-5990, doi: 10.1093/nar/gki912.

7. Cermak, T., Doyle, E. L., Christian, M., Wang, Li, Zhang, Y., et al. (2011) Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting, Nucleic Acids Res., 39, e82, doi: 10.1093/nar/gkr218.

8. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., et al. (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity, Science, 337, 816-821, doi: 10.1126/science.1225829.

9. Liu, M., Rehman, S., Tang, X., Gu, K., Fan, Q., et al. (2019) Methodologies for improving HDR Efficiency, Front. Genet., 9, doi: 10.3389/fgene.2018.00691.

10. Seol, J. H., Shim, E. Y., and Lee, S. E. (2018) Microhomology-mediated end joining: Good, bad and ugly, Mutat. Res., 809, 81-87, doi: 10.1016/j.mrfmmm.2017.07.002.

11. Davis, L., Zhang, Y., Maizels, N. (2018) Assaying repair at DNA nicks, Methods Enzymol., 601, 71-89, doi: 10.1016/bs.mie.2017.12.001.

12. Gallagher, D. N., and Haber, J. E. (2021) Single-strand template repair: Key insights to increase the efficiency of gene editing, Curr. Genet., 67, 747-753, doi: 10.1007/s00294-021-01186-z.

13. Hu, Z., Zhou, M., Wu, Y., Li, Z., Liu, X., et al. (2019) ssODN-mediated in-frame deletion with CRISPR/Cas9 restores FVIII function in hemophilia A-patient-derived iPSCs and ECs, Mol. Ther. Nucleic Acids, 17, 198-209, doi: 10.1016/j.omtn.2019.05.019.

14. Bennett, H., Aguilar-Martinez, E., and Adamson, A. D. (2021) CRISPR-mediated knock-in in the mouse embryo using long single stranded DNA donors synthesised by biotinylated PCR, Methods, 191, 3-14, doi: 10.1016/j.ymeth.2020.10.012.

15. Cristea, S., Freyvert, Y., and Santiago, Y. (2013) In vivo cleavage of transgene donors promotes nuclease-mediated targeted integration, Biotechnol. Bioeng., 110, 871-880, doi: 10.1002/bit.24733.

16. Fueller, J., Herbst, K., Meurer, M., Gubicza, K., Kurtulmus, B., et al. (2020) CRISPR-Cas12a-assisted PCR tagging of mammalian genes, J. Cell Biol., 219, e201910210, doi: 10.1083/jcb.201910210.

17. Bai, H., Liu, L., An, K., Lu, X., Harrison, M., et al. (2020) CRISPR/Cas9-mediated precise genome modification by a long ssDNA template in zebrafish, BMC Genomics, 21, 67, doi: 10.1186/s12864-020-6493-4.

18. Lim, D., Sreekanth, V., Cox, K. J., Law, B. K., Wagner, B. K., et al. (2020) Engineering designer beta cells with a CRISPR-Cas9 conjugation platform, Nat. Commun., 11, 4043, doi: 10.1038/s41467-020-17725-0.

19. Harmsen, T., Klaasen, S., van de Vrugt, H., Riele, H. T. (2018) DNA mismatch repair and oligonucleotide end-protection promote base-pair substitution distal from a CRISPR/Cas9-induced DNA break, Nucleic Acids Res., 46, 2945-2955, doi: 10.1093/nar/gky076.

20. Galagher, D. N., Pham, N., Tsai, A. M., Janto, N. V., Choi, J., et al. (2020) A Rad51-independent pathway promotes single-strand template repair in gene editing, PLoS Genet., 16, e1008689, doi: 10.1371/journal.pgen.1008689.

21. Serebrovskaya, E. O., Podvalnaya, N. M., Dudenkova, V. V., Efremova, A. S., Gurskaya, N. G., et al. (2020) Genetically encoded fluorescent sensor for poly-ADP-ribose, Int. J. Mol. Sci., 21, 5004, doi: 10.3390/ijms21145004.

22. Brinkman, E. K., Kousholt, A. N., Harmsen, T., Leemans, C., Chen, T., et al. (2018) Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing, Nucleic Acids Res., 46, e58, doi: 10.1093/nar/gky164.

23. Etard, C., Joshi, S., and Stegmaier, J., (2017) Tracking of indels by DEcomposition is a Simple and effective method to assess efficiency of guide RNAs in zebrafish, Zebrafish, 14, 586-588, doi: 10.1089/zeb.2017.1454.

24. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., and Pruett-Miller, S. M. (2018) A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing, Sci. Rep., 8, 888, doi: 10.1038/s41598-018-19441-8.