Параметры отставленного нейровоспаления после фокального ишемического инсульта коры головного мозга у мышей зависят от размера очага в начале подострой стадии

Аннотация

Динамика изменения активности глии в подострой и хронической стадии ишемического инсульта после малых фокальных повреждений остается малоизученной из‑за сложности долгосрочного наблюдения за животными и интерпретации данных. Целью данного исследования была оценка связи отставленных морфологических изменений в нервной ткани при экспериментальном инсульте с параметрами очага, определяемыми прижизненно на различных сроках. Для этого у мышей C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6f)GP5.17Dkim/J, которые экспрессируют в нейронах коры головного мозга флуоресцентный белковый сенсор кальция (GCaMP6f), вызывали фотоиндуцированную ишемию коры больших полушарий. Размер очага определяли методом широкопольной оптической нейровизуализации через краниальное окно по флуоресценции GCaMP6f через 3 мин, через 1 сутки и через 7 суток после фототромбоза. Через 19 суток проводили анализ срезов мозга, окрашенных по Нисслю и гистохимически на маркеры микроглии (Iba1) и астроцитов (GFAP). Выявлено, что признаки нейровоспаления – изменение морфологии и количества клеток глии – сохраняются в перифокальной зоне через 19 суток после индукции ишемии, несмотря на малый объем повреждения. Была обнаружена значимая линейная зависимость площади ядер микроглиальных клеток от размера очага на 7‑е сутки. В свою очередь, значимой зависимости между размерами очага, определяемыми в острейшей фазе (через 3 мин), а также в острой фазе (1‑е сутки) и параметрами клеток (количество клеток, морфометрические параметры) установлено не было. Это значит, что процесс формирования очага в острую фазу динамичен, и на долгосрочные исходы инсульта влияет лишь размер очага после его оформления. Отсутствие связи параметров отставленных изменений глии с размером очага во время острой и острейшей фазы указывает на то, что терапевтическое окно для реабилитационных мероприятий, модулирующих глиальную активность, может охватывать отдаленный период после инсульта даже при малом размере очага повреждения. Также важность этого вывода связана с отсутствием необходимости введения поправки на начальный размер повреждения при исследованиях отставленных процессов в нейроглии на доклинических моделях при малом или среднем размере очага. В свою очередь, наличие связи площади очага на 7‑е сутки и площади ядер клеток микроглии на 19‑е сутки демонстрирует, что размер очага на конец острой фазы может быть одним из прогностических факторов эффективности постинсультной терапии.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Дополнительные материалы

Приложение

Вклад авторов

Бакаева З.В. – концепция, руководство; Алексеев В.И., Кислухина Е.Н., Лизунова Н.В. – проведение экспериментов, анализ данных; Алексеев В.И., Кислухина Е.Н., Лизунова Н.В., Липина Т.В., Бакаева З.В. – обсуждение результатов исследования; Алексеев В.И., Кислухина Е.Н. – написание текста; Лизунова Н.В., Липина Т.В., Сурин А.М., Бакаева З.В. – редактирование текста; Сурин А.М., Савостьянов К.В. – администрирование, финансирование работы.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке Минздрава России (проект № ААААА19-119012590191‑3), а также за счет средств Государственного задания № FGFU-2025-0004 и Государственного задания МГУ имени М.В. Ломоносова. Оборудование для исследования приобретено в рамках гранта в форме субсидии Министерства науки и высшего образования Российской Федерации по программе обновления приборной базы НИОКР (внутренний номер 08-07-S6/2021/82930).

Благодарности

Благодарим Попову Ирину Юрьевну (ИТЭБ РАН) за помощь в приготовлении и окрашивании срезов. Благодарим Горбачеву Любовь Руфэльевну (МГУ имени М.В. Ломоносова) за предоставление доступа к ЛСКМ.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Эксперимент был проведен в соответствии с требованиями Директивы Европейского парламента и Совета ЕС 2010/63/ЕС от 22 сентября 2010 г. о защите животных, использующихся для научных целей. Проведение экспериментов осуществлялось в соответствии с требованиями этических комитетов Института общей патологии и патофизиологии (протокол № 05‑06/12 от 14 декабря 2017 г.) и Национального медицинского исследовательского центра здоровья детей Минздрава РФ (протокол № 05 от 15 мая 2025 г.).

Список литературы

1. GBD 2021 Stroke Risk Factor Collaborators (2024) Global, regional, and national burden of stroke and its risk factors, 1990-2021: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021, Lancet Neurol., 23, 973-1003, https://doi.org/10.1016/S1474-4422(24)00369-7.

2. Salaudeen, M. A., Bello, N., Danraka, R. N., and Ammani, M. L. (2024) Understanding the pathophysiology of ischemic stroke: the basis of current therapies and opportunity for new ones, Biomolecules, 14, 305, https://doi.org/10.3390/biom14030305.

3. Caleo, M. (2015) Rehabilitation and plasticity following stroke: Insights from rodent models, Neuroscience, 311, 180-194, https://doi.org/10.1016/j.neuroscience.2015.10.029.

4. Khan, M. (2023) Rehabilitation in animal models of stroke, Phys. Ther. Res., 26, R0022, https://doi.org/10.1298/ptr.R0022.

5. Jablonka, J. A., Burnat, K., Witte, O. W., and Kossut, M. (2010) Remapping of the somatosensory cortex after a photothrombotic stroke: dynamics of the compensatory reorganization, Neuroscience, 165, 90-100, https://doi.org/10.1016/j.neuroscience.2009.09.074.

6. Shabani, Z., Farhoudi, M., Rahbarghazi, R., Karimipour, M., and Mehrad, H. (2023) Cellular, histological, and behavioral pathological alterations associated with the mouse model of photothrombotic ischemic stroke, J. Chem. Neuroanat., 130, 102261, https://doi.org/10.1016/j.jchemneu.2023.102261.

7. Matur, A. V., Candelario-Jalil, E., Paul, S., Karamyan, V. T., Lee, J. D., Pennypacker, K., and Fraser, J. F. (2023) Translating animal models of ischemic stroke to the human condition, Translat. Stroke Res., 14, 842-853, https://doi.org/10.1007/s12975-022-01082-9.

8. Brown, A. W., and Brierley, J. B. (1973) The earliest alterations in rat neurones and astrocytes after anoxia-ischaemia, Acta Neuropathol., 23, 9-22, https://doi.org/10.1007/BF00689000.

9. Ostrova, I. V., Babkina, A. S., Lyubomudrov, M. A., Grechko, A. V., and Golubev, A. M. (2023) Photochemically induced thrombosis as a model of ischemic stroke, Gen. Reanimatol., 19, 54-65, https://doi.org/10.15360/1813-9779-2023-3-54-65.

10. Luo, Y., Xia, Y., Zhang, H., Lin, Y., He, L., Gong, T., Zhang, Z., and Deng, L. (2023) Human serum albumin-enriched clopidogrel bisulfate nanoparticle alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in rats, Pharmaceut. Res., 40, 1821-1833, https://doi.org/10.1007/s11095-023-03543-8.

11. Jolkkonen, J., Jokivarsi, K., Laitinen, T., and Gröhn, O. (2007) Subacute hemorrhage and resolution of edema in Rose Bengal stroke model in rats coincides with improved sensorimotor functions, Neurosci. Lett., 428, 99-102, https://doi.org/10.1016/j.neulet.2007.09.043.

12. Schroeter, M., Jander, S., and Stoll, G. (2002) Non-invasive induction of focal cerebral ischemia in mice by photothrombosis of cortical microvessels: characterization of inflammatory responses, J. Neurosci. Methods, 117, 43-49, https://doi.org/10.1016/S0165-0270(02)00072-9.

13. Padawer-Curry, J. A., Bowen, R. M., Jarang, A., Wang, X., Lee, J.-M., and Bauer, A. Q. (2023) Wide-field optical imaging in mouse models of ischemic stroke, in Neural Repair. Methods in Molecular Biology vol. 2616 (Karamyan, V. T., Stowe, A. M., eds), Humana, New York, https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2926-0_11.

14. Kislukhina, E. N., Lizunova, N. V., Surin, A. M., and Bakaeva, Z. V. (2025) The protocol for mesoscopic wide-field optical imaging in mice: from zero to hero, Biol. Methods Protoc., 11, bpaf090, https://doi.org/10.1101/2025.07.31.667912.

15. Planas, A. M. (2024) Role of microglia in stroke, Glia, 72, 1016-1053, https://doi.org/10.1002/glia.24501.

16. Stuckey, S. M., Ong, L. K., Collins-Praino, L. E., and Turner, R. J. (2021) Neuroinflammation as a key driver of secondary neurodegeneration following stroke? Int. J. Mol. Sci., 22, 13101, https://doi.org/10.3390/ijms222313101.

17. Lizunova, N. V., Kislukhina, E. N., and Surin, A. M. (2022) Perinatal stroke: modelling and the potential of neurovisualization, Russ. Pediatr. J., 25, 128-138, https://doi.org/10.46563/1560-9561-2022-25-2-128-138.

18. Dana, H., Chen, T.-W., Hu, A., Shields, B. C., Guo, C., Looger, L. L., Kim, D. S., and Svoboda, K. (2014) Thy1-GCaMP6 transgenic mice for neuronal population imaging in vivo, PLoS One, 9, e108697, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0108697.

19. Кислухина Е. Н., Лизунова Н. В., Лисина О. Ю., Шарипов, Р. Р., Красильникова И. А., Бакаева З. В., Пинелис В. Г., Сурин А. М. (2023) Индуцированные глутаматом и ишемией изменения ионного гомеостаза в нейрональной культуре и коре головного мозга мышей, экспрессирующих Ca2+-сенсор GCaMP6f, Патол. Физиол. Эксп. Тер., 67, 5-20, https://doi.org/10.25557/0031-2991.2023.01.5-20.

20. Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., and Ziebell, J. (2015) Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons, J. Visual. Exp., 99, e52293, https://doi.org/10.3791/52293.

21. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J.-Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P., and Cardona, A. (2012) Fiji: an open-source platform for biological-image analysis, Nat. Methods, 9, 676-682, https://doi.org/10.1038/nmeth.2019.

22. Berg, S., Kutra, D., Kroeger, T., Straehle, C. N., Kausler, B. X., Haubold, C., Schiegg, M., Ales, J., Beier, T., Rudy, M., Eren, K., Cervantes, J. I., Xu, B., Beuttenmueller, F., Wolny, A., Zhang, C., Koethe, U., Hamprecht, F. A., and Kreshuk, A. (2019) ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis, Nat. Methods, 16, 1226-1232, https://doi.org/10.1038/s41592-019-0582-9.

23. Ollion, J., Cochennec, J., Loll, F., Escudé, C., and Boudier, T. (2013) TANGO: a generic tool for high-throughput 3D image analysis for studying nuclear organization, Bioinforcmatics, 29, 1840-1841, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btt276.

24. Heindl, S., Gesierich, B., Benakis, C., Llovera, G., Duering, M., and Liesz, A. (2018) Automated morphological analysis of microglia after stroke, Front. Cell. Neurosci., 12, 106, https://doi.org/10.3389/fncel.2018.00106.

25. Leyh, J., Paeschke, S., Mages, B., Michalski, D., Nowicki, M., Bechmann, I., and Winter, K. (2021) Classification of microglial morphological phenotypes using machine learning, Front. Cell. Neurosci., 15, 701673, https://doi.org/10.3389/fncel.2021.701673.

26. Patel, A. R., Ritzel, R., McCullough, L. D., and Liu, F. (2013) Microglia and ischemic stroke: a double-edged sword, Int. J. Physiol. Pathophysiol. Pharmacol., 5, 73-90.

27. Choudhury, G. R., and Ding, S. (2016) Reactive astrocytes and therapeutic potential in focal ischemic stroke, Neurobiol. Disease, 85, 234-244, https://doi.org/10.1016/j.nbd.2015.05.003.

28. Taylor, R. A., and Sansing, L. H. (2013) Microglial responses after ischemic stroke and intracerebral hemorrhage, Clin. Dev. Immunol., 2013, 746068, https://doi.org/10.1155/2013/746068.

29. Zhang, S. (2019) Microglial activation after ischaemic stroke, Stroke Vasc. Neurol., 4, 71-74, https://doi.org/10.1136/svn-2018-000196.

30. Perego, C., Fumagalli, S., and de Simoni, M.-G. (2013) Three-dimensional confocal analysis of microglia/macrophage markers of polarization in experimental brain injury, J. Visual. Exp., 79, 50605, https://doi.org/10.3791/50605.

31. Derecki, N., Norris, G., Derecki, N., and Kipnis, J. (2014) Microglial Sholl analysis, Protocol Exchange, https://doi.org/10.1038/protex.2014.029.

32. Morrison, H. W., and Filosa, J. A. (2013) A quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion, J. Neuroinflamm., 10, 782, https://doi.org/10.1186/1742-2094-10-4.

33. Sun, L., Zhang, Y., Liu, E., Ma, Q., Anatol, M., Han, H., and Yan, J. (2019) The roles of astrocyte in the brain pathologies following ischemic stroke, Brain Injury, 33, 712-716, https://doi.org/10.1080/02699052.2018.1531311.

34. Denes, A., Vidyasagar, R., Feng, J., Narvainen, J., McColl, B. W., Kauppinen, R. A., and Allan, S. M. (2007) Proliferating resident microglia after focal cerebral ischaemia in mice, J. Cerebral Blood Flow Metab., 27, 1941-1953, https://doi.org/10.1038/sj.jcbfm.9600495.

35. Garcia, J. H., Liu, K.-F., and Ho, K.-L. (1995) Neuronal necrosis after middle cerebral artery occlusion in Wistar rats progresses at different time intervals in the caudoputamen and the cortex, Stroke, 26, 636-643, https://doi.org/10.1161/01.STR.26.4.636.

36. Demyanenko, S. V., Panchenko, S. N., and Uzdensky, A. B. (2015) Expression of neuronal and signaling proteins in penumbra around a photothrombotic infarction core in rat cerebral cortex, Biochemistry (Moscow), 80, 790-799, https://doi.org/10.1134/S0006297915060152.

37. Heiss, W.-D., and Zaro-Weber, O. (2019) Extension of therapeutic window in ischemic stroke by selective mismatch imaging, Int. J. Stroke, 14, 351-358, https://doi.org/10.1177/1747493019840936.

38. Cotrina, M. L., Lou, N., Tome-Garcia, J., Goldman, J., and Nedergaard, M. (2017) Direct comparison of microglial dynamics and inflammatory profile in photothrombotic and arterial occlusion evoked stroke, Neuroscience, 343, 483-494, https://doi.org/10.1016/j.neuroscience.2016.12.012.

39. Gelderblom, M., Leypoldt, F., Steinbach, K., Behrens, D., Choe, C.-U., Siler, D. A., Arumugam, T. v., Orthey, E., Gerloff, C., Tolosa, E., and Magnus, T. (2009) Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke, Stroke, 40, 1849-1857, https://doi.org/10.1161/STROKEAHA.108.534503.

40. Fernández-Arjona, M. M., Grondona, J. M., Granados-Durán, P., Fernández-Llebrez, P., and López-Ávalos, M. D. (2017) Microglia morphological categorization in a rat model of neuroinflammation by hierarchical cluster and principal components analysis, Front. Cell. Neurosci., 11, 235, https://doi.org/10.3389/fncel.2017.00235.

41. Williamson, M. R., Fuertes, C. J. A., Dunn, A. K., Drew, M. R., and Jones, T. A. (2021) Reactive astrocytes facilitate vascular repair and remodeling after stroke, Cell Rep., 35, 109048, https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109048.

42. Kluge, M. G., Abdolhoseini, M., Zalewska, K., Ong, L. K., Johnson, S. J., Nilsson, M., and Walker, F. R. (2019) Spatiotemporal analysis of impaired microglia process movement at sites of secondary neurodegeneration post-stroke, J. Cerebral Blood Flow Metab., 39, 2456-2470, https://doi.org/10.1177/0271678X18797346.

43. Jiang, C., Wu, W., Deng, Y., and Ge, J. (2020) Modulators of microglia activation and polarization in ischemic stroke (review), Mol. Med. Rep., 21, 2006-2018, https://doi.org/10.3892/mmr.2020.11003.

44. Li, T., Pang, S., Yu, Y., Wu, X., Guo, J., and Zhang, S. (2013) Proliferation of parenchymal microglia is the main source of microgliosis after ischaemic stroke, Brain, 136, 3578-3588, https://doi.org/10.1093/brain/awt287.

45. Golubev, A. M., Sundukov, D. V., Bashirova, A. R., and Golubev, M. A. (2012) Brain morphological changes in acute combined intoxication with asaleptin and ethyl alcohol, Gen. Reanimatol., 8, 31, https://doi.org/10.15360/1813-9779-2012-6-31.

46. Nowicka, D., Rogozinska, K., Aleksy, M., Witte, O., and Skangiel-Kramska, J. (2008) Spatiotemporal dynamics of astroglial and microglial responses after photothrombotic stroke in the rat brain, Acta Neurobiol. Exp., 68, 155-168, https://doi.org/10.55782/ane-2008-1685.