Двухстадийная очистка рекомбинантных антител с неионным детергентом предотвращает эндотоксин-индуцированную активацию макрофагов: пример биспецифичного мини‑антитела MYSTI‑2

Аннотация

Escherichia coli является одним из самых распространенных продуцентов рекомбинантных белков, в том числе фрагментов терапевтических антител. Однако клеточная мембрана E. coli содержит большое количество липополисахарида (LPS) или эндотоксина, который через рецепторы врожденного иммунитета может активировать иммунный ответ и вызывать системное воспаление вплоть до септического шока. Таким образом, обеспечение экстремально низкого уровня эндотоксина в препаратах, применяемых in vivo, является крайне важной задачей. В работе было исследовано содержание эндотоксина в препаратах биспецифичного мини-антитела MYSTI‑2, полученных из экспрессионного штамма Rosetta c обычными формами LPS и штамма ClearColi с потенциально нетоксичными формами LPS. Показано, что только использование в процессе очистки неионного детергента позволяет почти полностью удалить примеси LPS в препаратах независимо от штамма-продуцента.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Вклад авторов

МСД, САН, ИИВ – концепция, руководство работой; ЮАХ, МСД, ИИВ – написание текста; ЮАХ, МСД, ИИВ – иллюстрирование; ЮАХ, АМЛ, ФАС, МСД, ИВС – получение экспериментальных данных и обработка результатов; МСД, ИВС, САН, ИИВ – редактирование статьи.

Финансирование

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 19-75-30032).

Благодарности

Авторы выражают благодарность Марку Лапунову (Сеченовский медицинский университет, Москва) за проведение экспериментов по культивации штаммов-продуцентов MYSTI‑2.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены. Работу с лабораторными животными осуществляли в строгом соответствии с нормами FELASА (Федерация европейских ассоциаций лабораторных животных), получив одобрение биоэтической комиссии ИМБ РАН (Протокол № 1 от 05.03.2025).

Список литературы

1. Raetz, C. R. (1990) Biochemistry of endotoxins, Annu. Rev. Biochem., 59, 129-170, https://doi.org/10.1146/annurev.bi.59.070190.001021.

2. Petsch, D., and Anspach, F. B. (2000) Endotoxin removal from protein solutions, J. Biotechnol., 76, 97-119, https://doi.org/10.1016/s0168-1656(99)00185-6.

3. Bryant, C. E., Spring, D. R., Gangloff, M., and Gay, N. J. (2010) The molecular basis of the host response to lipopolysaccharide, Nat. Rev. Microbiol., 8, 8-14, https://doi.org/10.1038/nrmicro2266.

4. Franco, E., Garcia-Recio, V., Jiménez, P., Garrosa, M., Girbés, T., Cordoba-Diaz, M., and Cordoba-Diaz, D. (2018) Endotoxins from a pharmacopoeial point of view, Toxins, 10, 8, https://doi.org/10.3390/toxins10080331.

5. Nabhan, M., Meunier, S., Le-Minh, V., Robin, B., de Bourayne, M., Smadja, C., Maillère, B., Pallardy, M., and Turbica, I. (2024) Infliximab aggregates produced in severe and mild elevated temperature stress conditions induce an extended specific CD4 T-cell response, Eur. J. Pharm. Sci., 192, 106670, https://doi.org/10.1016/j.ejps.2023.106670.

6. Sharma, A., Kumar, N., Kuppermann, B. D., Bandello, F., and Loewenstein, A. (2020) Ophthalmic biosimilars and biologics-role of endotoxins, Eye (Lond), 34, 614-615, https://doi.org/10.1038/s41433-019-0636-3.

7. Wang, F., Yu, S., Liu, K., Chen, F. E., Song, Z., Zhang, X., Xu, X., and Sun, X. (2013) Acute intraocular inflammation caused by endotoxin after intravitreal injection of counterfeit bevacizumab in Shanghai, China, Ophthalmology, 120, 355-361, https://doi.org/10.1016/j.ophtha.2012.07.083.

8. Lopes, A. M., Santos-Ebinuma Vde, C., Novaes, L. C., Molino, J. V., Barbosa, L. R., Pessoa, A., Jr., and Rangel-Yagui Cde, O., Jr. (2013) LPS-protein aggregation influences protein partitioning in aqueous two-phase micellar systems, Appl. Microbiol. Biotechnol., 97, 6201-6209, https://doi.org/10.1007/s00253-013-4922-x.

9. Lieder, R., Petersen, P. H., and Sigurjónsson Ó, E. (2013) Endotoxins-the invisible companion in biomaterials research, Tissue Eng. Part B Rev., 19, 391-402, https://doi.org/10.1089/ten.TEB.2012.0636.

10. Anspach, F. B. (2001) Endotoxin removal by affinity sorbents, J. Biochem. Biophys. Methods, 49, 665-681, https://doi.org/10.1016/s0165-022x(01)00228-7.

11. Park, B. S., Song, D. H., Kim, H. M., Choi, B. S., Lee, H., and Lee, J. O. (2009) The structural basis of lipopolysaccharide recognition by the TLR4-MD-2 complex, Nature, 458, 1191-1195, https://doi.org/10.1038/nature07830.

12. Meredith, T. C., Aggarwal, P., Mamat, U., Lindner, B., and Woodard, R. W. (2006) Redefining the requisite lipopolysaccharide structure in Escherichia coli, ACS Chem. Biol., 1, 33-42, https://doi.org/10.1021/cb0500015.

13. Mamat, U., Wilke, K., Bramhill, D., Schromm, A. B., Lindner, B., Kohl, T. A., Corchero, J. L., Villaverde, A., Schaffer, L., Head, S. R., Souvignier, C., Meredith, T. C., and Woodard, R. W. (2015) Detoxifying Escherichia coli for endotoxin-free production of recombinant proteins, Microb. Cell Factor., 14, 57, https://doi.org/10.1186/s12934-015-0241-5.

14. Ueda, T., Akuta, T., Kikuchi-Ueda, T., Imaizumi, K., and Ono, Y. (2016) Improving the soluble expression and purification of recombinant human stem cell factor (SCF) in endotoxin-free Escherichia coli by disulfide shuffling with persulfide, Protein Express. Purif., 120, 99-105, https://doi.org/10.1016/j.pep.2015.12.015.

15. Liang, Q., Tu, B., and Cui, L. (2024) Recombinant T7 RNA polymerase production using ClearColi BL21(DE3) and animal-free media for in vitro transcription, Appl. Microbiol. Biotechnol., 108, 41, https://doi.org/10.1007/s00253-023-12939-w.

16. Nguyen, T. K. O., Vu, T. L., Nguyen, M. Q., Ta, H. K. K., Park, K. S., Kim, S. H., Kim, C. J., Jang, Y. J., and Choe, H. (2021) Soluble prokaryotic overexpression and purification of human GM-CSF using the protein disulfide isomerase b′a′ Domain, Int. J. Mol. Sci., 22, 10, https://doi.org/10.3390/ijms22105267.

17. Efimov, G. A., Kruglov, A. A., Khlopchatnikova, Z. V., Rozov, F. N., Mokhonov, V. V., Rose-John, S., Scheller, J., Gordon, S., Stacey, M., Drutskaya, M. S., Tillib, S. V., and Nedospasov, S. A. (2016) Cell-type-restricted anti-cytokine therapy: TNF inhibition from one pathogenic source, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 113, 3006-3011, https://doi.org/10.1073/pnas.1520175113.

18. Conrad, U., Plagmann, I., Malchow, S., Sack, M., Floss, D. M., Kruglov, A. A., Nedospasov, S. A., Rose-John, S., and Scheller, J. (2011) ELPylated anti-human TNF therapeutic single-domain antibodies for prevention of lethal septic shock, Plant Biotechnol. J., 9, 22-31, https://doi.org/10.1111/j.1467-7652.2010.00523.x.

19. Coppieters, K., Dreier, T., Silence, K., de Haard, H., Lauwereys, M., Casteels, P., Beirnaert, E., Jonckheere, H., Van de Wiele, C., Staelens, L., Hostens, J., Revets, H., Remaut, E., Elewaut, D., and Rottiers, P. (2006) Formatted anti-tumor necrosis factor alpha VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collagen-induced arthritis, Arthrit. Rheum., 54, 1856-1866, https://doi.org/10.1002/art.21827.

20. Plagmann, I., Chalaris, A., Kruglov, A. A., Nedospasov, S., Rosenstiel, P., Rose-John, S., and Scheller, J. (2009) Transglutaminase-catalyzed covalent multimerization of Camelidae anti-human TNF single domain antibodies improves neutralizing activity, J. Biotechnol., 142, 170-178, https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2009.04.002.

21. Studier, F. W. (2005) Protein production by auto-induction in high density shaking cultures, Protein Express. Purif., 41, 207-234, https://doi.org/10.1016/j.pep.2005.01.016.

22. Olleros, M. L., Chavez-Galan, L., Segueni, N., Bourigault, M. L., Vesin, D., Kruglov, A. A., Drutskaya, M. S., Bisig, R., Ehlers, S., Aly, S., Walter, K., Kuprash, D. V., Chouchkova, M., Kozlov, S. V., Erard, F., Ryffel, B., Quesniaux, V. F., Nedospasov, S. A., and Garcia, I. (2015) Control of mycobacterial infections in mice expressing human tumor necrosis factor (TNF) but not mouse TNF, Infect. Immun., 83, 3612-3623, https://doi.org/10.1128/IAI.00743-15.

23. Pearson, F. C., Weary, M. E., Sargent, H. E., Novitsky, T. J., Lin, H., Lindsay, G., Berzofsky, R. N., Lane, A. L., Wilson, J. D., Cooper, J. F., et al. (1985) Comparison of several control standard endotoxins to the National Reference Standard Endotoxin – an HIMA collaborative study, Appl. Environ. Microbiol., 50, 91-93, https://doi.org/10.1128/aem.50.1.91-93.1985.

24. Grivennikov, S. I., Tumanov, A. V., Liepinsh, D. J., Kruglov, A. A., Marakusha, B. I., Shakhov, A. N., Murakami, T., Drutskaya, L. N., Forster, I., Clausen, B. E., Tessarollo, L., Ryffel, B., Kuprash, D. V., and Nedospasov, S. A. (2005) Distinct and nonredundant in vivo functions of TNF produced by t cells and macrophages/neutrophils: protective and deleterious effects, Immunity, 22, 93-104, https://doi.org/10.1016/j.immuni.2004.11.016.

25. Kruglov, A. A., Tumanov, A. V., Grivennikov, S. I., Shebzukhov, Y. V., Kuchmiy, A. A., Efimov, G. A., Drutskaya, M. S., Scheller, J., Kuprash, D. V., and Nedospasov, S. A. (2011) Modalities of experimental TNF blockade in vivo: mouse models, Adv. Exp. Med. Biol., 691, 421-431, https://doi.org/10.1007/978-1-4419-6612-4_44.

26. Pi, W., Sun, C., Song, Z., Ma, L., Liu, S., Bai, D., Cai, Y., and Liu, S. (2007) Purification of plasmid DNA using anion-exchange chromatography and removal of endotoxin [In Chinese], Se Pu, 25, 809-813, https://doi.org/10.1016/s1872-2059(08)60003-6.

27. Stanek, O., Masin, J., Osicka, R., Jurnecka, D., Osickova, A., and Sebo, P. (2019) Rapid purification of endotoxin-free RTX toxins, Toxins, 11, 6, https://doi.org/10.3390/toxins11060336.