Биспецифичное мини-антитело с модулем анти‑CD14 эффективно контролирует биодоступность фактора некроза опухолей человека, продуцируемого моноцитами человека

Аннотация

Системная блокировка провоспалительных цитокинов, таких как IL‑1, TNF и IL‑6, с помощью терапевтических антител оказалась эффективной при целом ряде аутоиммунных и других хронических заболеваний с воспалительным компонентом. С другой стороны, такая блокировка подавляет также и невырожденные защитные и гомеостатические функции цитокинов и поэтому сопряжена с рядом нежелательных побочных эффектов. В этой работе новое биспецифичное мини-антитело с модулями, связывающими TNF и CD14 человека, показало эффективность в контроле секреции TNF из моноцитов периферической крови человека. Введение этого антитела защищало гуманизованных по TNF мышей от летальной гепатотоксичности, вызванной комбинацией липополисахарида и D‑галактозамина.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Вклад авторов

И.К. провел эксперименты in vitro и цитометрический анализ; К.К. собрал и верифицировал экспрессионную конструкцию; С.К. провел амплификацию и клонирование антиген-распознающих доменов гибридомы ТМ‑1; Д.Д. осуществил экспрессию и очистку биспецифичного мини-антитела; А.Л. провела эксперименты с моноцитарными клетками in vitro; Н.Д. провела клонирование гибридомы; С.Р. провел цитометрический анализ; Е.Г. отобрала высокопродуцирующие клоны моноклональных антител; Ф.С. провел эксперименты in vivo; М.С. – планирование экспериментов in vivo, написание и редактирование текста, руководство исследованием; С.Н. – идея и руководство исследованием, написание текста, ответы рецензентам. Все авторы приняли участие в обсуждении результатов и финального варианта статьи.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 19-75-30032). Эксперименты по валидации биспецифичного антитела in vitro проводили в НТУ «Сириус» в рамках соглашения 18‑03 от 10.09.2024.

Благодарности

Авторы благодарят д‑ра Ziegler-Heitbrock за советы, А.Н. Шумеева за помощь в цитометрии, А.В. Воронцова за помощь в отборе гибридомных клонов, Е.А. Горшкову, А.С. Яковлеву, И.В. Астраханцеву, А.В. Боголюбову-Кузнецову и А.Г. Катруху за содействие этому исследованию.

Конфликт интересов

С.А.Н. является автором патента № 2852369, остальные авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Работу с лабораторными животными осуществляли в строгом соответствии с нормами FELASА, с рекомендациями RUS‑LASA и одобрены комиссией по биоэтике ИМБ РАН (протокол № 1 от 05.03.2025). Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием людей, соответствуют этическим стандартам национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 года и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики. Исследование было одобрено комитетом по биоэтике НТУ «Сириус», протокол от 06.03.2023. От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Список литературы

1. Grivennikov, S. I., Tumanov, A. V., Liepinsh, D. J., Kruglov, A. A., Marakusha, B. I., Shakhov, A. N., Murakami, T., Drutskaya, L. N., Förster, I., Clausen, B. E., Tessarollo, L., Ryffel, B., Kuprash, D. V., and Nedospasov, S. A. (2005) Distinct and nonredundant in vivo functions of TNF produced by T cells and macrophages/neutrophils: protective and deleterious effects, Immunity, 22, 93-104, https://doi.org/10.1016/j.immuni.2004.11.016.

2. Kruglov, A. A., Drutskaya, M. S., Schlienz, D., Gorshkova, E. N., Kurz, K., Morawietz, L., and Nedospasov, S. A. (2020) Contrasting contributions of TNF from distinct cellular sources in arthritis, Ann. Rheum. Dis., 79, 1453-1459, https://doi.org/10.1136/annrheumdis-2019-216068.

3. Tumanov, A. V., Grivennikov, S. I., Kruglov, A. A., Shebzukhov, Y. V., Koroleva, E. P., Piao, Y., Cui, C. Y., Kuprash, D. V., and Nedospasov, S. A. (2010) Cellular source and molecular form of TNF specify its distinct functions in organization of secondary lymphoid organs, Blood, 116, 3456-3464, https://doi.org/10.1182/blood-2009-10-249177.

4. Allie, N., Grivennikov, S. I., Keeton, R., Hsu, N. J., Bourigault, M. L., Court, N., Fremond, C., Yeremeev, V., Shebzukhov, Y., Ryffel, B., Nedospasov, S. A., Quesniaux, V. F., and Jacobs, M. (2013) Prominent role for T cell-derived tumour necrosis factor for sustained control of Mycobacterium tuberculosis infection, Sci. Rep., 3, 1809, https://doi.org/10.1038/srep01809.

5. Kroetsch, J. T., Levy, A. S., Zhang, H., Aschar-Sobbi, R., Lidington, D., Offermanns, S., Nedospasov, S. A., Backx, P. H., Heximer, S. P., and Bolz, S. S. (2017) Constitutive smooth muscle tumour necrosis factor regulates microvascular myogenic responsiveness and systemic blood pressure, Nat. Commun., 8, 14805, https://doi.org/10.1038/ncomms14805.

6. Efimov, G. A., Kruglov, A. A., Khlopchatnikova, Z. V., Rozov, F. N., Mokhonov, V. V., Rose-John, S., Scheller, J., Gordon, S., Stacey, M., Drutskaya, M. S., Tillib, S. V., and Nedospasov, S. A. (2016) Cell-type-restricted anti-cytokine therapy: TNF inhibition from one pathogenic source, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 113, 3006-3011, https://doi.org/10.1073/pnas.1520175113.

7. Drutskaya, M. S., Efimov, G. A., Kruglov, A. A., and Nedospasov, S. A. (2017) Can we design a better anti-cytokine therapy? J. Leukoc. Biol., 102, 783-790, https://doi.org/10.1189/jlb.3MA0117-025R.

8. Olleros, M. L., Chavez-Galan, L., Segueni, N., Bourigault, M. L., Vesin, D., Kruglov, A. A., Drutskaya, M. S., Bisig, R., Ehlers, S., Aly, S., Walter, K., Kuprash, D. V., Chouchkova, M., Kozlov, S. V., Erard, F., Ryffel, B., Quesniaux, V. F., Nedospasov, S. A., and Garcia, I. (2015) Control of mycobacterial infections in mice expressing human tumor necrosis factor (TNF) but not mouse TNF, Infect. Immun., 83, 3612-3623, https://doi.org/10.1128/IAI.00743-15.

9. Atretkhany, K. N., Mufazalov, I. A., Dunst, J., Kuchmiy, A., Gogoleva, V. S., Andruszewski, D., Drutskaya, M. S., Faustman, D. L., Schwabenland, M., Prinz, M., Kruglov, A. A., Waisman, A., and Nedospasov, S. A. (2018) Intrinsic TNFR2 signaling in T regulatory cells provides protection in CNS autoimmunity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 115, 13051-13056, https://doi.org/10.1073/pnas.1807499115.

10. Coppieters, K., Dreier, T., Silence, K., de Haard, H., Lauwereys, M., Casteels, P., Beirnaert, E., Jonckheere, H., Van de Wiele, C., Staelens, L., Hostens, J., Revets, H., Remaut, E., Elewaut, D., and Rottiers, P. (2006) Formatted anti-tumor necrosis factor alpha VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collagen-induced arthritis, Arthritis Rheum., 54, 1856-1866, https://doi.org/10.1002/art.21827.

11. Gordon, S., Hamann, J., Lin, H. H., and Stacey, M. (2011) F4/80 and the related adhesion-GPCRs, Eur. J. Immunol., 41, 2472-2476, https://doi.org/10.1002/eji.201141715.

12. Hamann, J., Koning, N., Pouwels, W., Ulfman, L. H., van Eijk, M., Stacey, M., Lin, H. H., Gordon, S., and Kwakkenbos, M. J. (2007) EMR1, the human homolog of F4/80, is an eosinophil-specific receptor, Eur. J. Immunol., 37, 2797-2802, https://doi.org/10.1002/eji.200737553.

13. Hass, R., Bartels, H., Topley, N., Hadam, M., Köhler, L., Goppelt-Strübe, M., and Resch, K. (1989) TPA-induced differentiation and adhesion of U937 cells: changes in ultrastructure, cytoskeletal organization and expression of cell surface antigens, Eur. J. Cell. Biol., 48, 282-293.

14. Meyer, L., López, T., Espinosa, R., Arias, C. F., Vollmers, C., and DuBois, R. M. (2019) A simplified workflow for monoclonal antibody sequencing, PLoS One, 14, e0218717, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0218717.

15. Ziegler-Heitbrock, H. W., Thiel, E., Fütterer, A., Herzog, V., Wirtz, A., and Riethmüller, G. (1988) Establishment of a human cell line (Mono Mac 6) with characteristics of mature monocytes, Int. J. Cancer, 41, 456-461, https://doi.org/10.1002/ijc.2910410324.

16. Haas, J. G., Meyer, N., Riethmüller, G., and Ziegler-Heitbrock, H. W. (1990) Inhibition of lipopolysaccharide-induced in vitro desensitization by interferon-gamma, Eur. J. Immunol., 20, 1181-1184, https://doi.org/10.1002/eji.1830200535.

17. Kriegler, M., Perez, C., DeFay, K., Albert, I., and Lu, S. D. (1988) A novel form of TNF/cachectin is a cell surface cytotoxic transmembrane protein: ramifications for the complex physiology of TNF, Cell, 53, 45-53, https://doi.org/10.1016/0092-8674(88)90486-2.

18. Shebzukhov, Y., Holtze, S., Hirseland, H., Schäfer, H., Radbruch, A., Hildebrandt, T., and Grützkau, A. (2019) Identification of cross-reactive antibodies for the detection of lymphocytes, myeloid cells and haematopoietic precursors in the naked mole rat, Eur. J. Immunol., 49, 2103-2110, https://doi.org/10.1002/eji.201948124.