Биохимическое обоснование разработки клинико-лабораторного теста для спектрофотометрической диагностики нарушений минерального гомеостаза у пациентов с мультифокальным атеросклерозом

Аннотация

Пациенты с коронарным и церебральным атеросклерозом характеризуются повышенной молярной концентрацией общего и ионизированного кальция, а также фосфат-аниона на фоне снижения концентрации общего белка и альбумина в плазме крови. Целью данной работы была разработка биохимического обоснования экспресс-теста для диагностики нарушений минерального гомеостаза, основанного на оценке способности кислых белков крови связывать избыточные ионы кальция и фосфора. В качестве биоматериала была использована плазма крови костных рыб, амфибий, рептилий, птиц, мышей и пациентов с инфарктом миокарда, инкубированная с избыточными концентрациями кальция и фосфора при 37 °C на различных временных точках. В качестве измеряемых параметров теста были приняты: 1) оптическая плотность плазмы крови после её перенасыщения ионами кальция и фосфора, отражающая избыточное формирование комплексов фосфата кальция и кислых белков крови (кальципротеиновых частиц, КПЧ); 2) концентрация КПЧ в плазме крови. КПЧ формировались у всех указанных классов позвоночных животных. Наиболее активное формирование КПЧ в плазме крови отмечалось у человека и мыши, что позволило предположить эволюционную значимость формирования КПЧ как механизма выведения избыточных циркулирующих ионов кальция и фосфора у млекопитающих. Из 11 вариантов перенасыщения ионами кальция и фосфора стабильное формирование КПЧ наблюдалось при добавлении к плазме крови (80 мкл) растворов CaCl₂ (+2 ммоль/л, +50 мкл), Na₂HPO₄∙12H₂O (+2 ммоль/л, +50 мкл) и NaCl (+15,4 ммоль/л, +20 мкл). Формирование КПЧ стабильно детектировалось в течение 10 минут после начала реакции в лунках планшета при инкубации в термошейкере (37 °C), с умеренной вариабельностью между параллельными или последовательными измерениями, а также различными операторами. Полученные результаты подтверждают актуальность валидации разработанной тест-системы для оценки нарушений минерального гомеостаза на расширенных выборках пациентов с инфарктом миокарда и ишемическим инсультом.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Вклад авторов

А.Г. Кутихин, Д.К. Шишкова – концепция и руководство работой; А.А. Исаметов – получение биоматериала; Д.К. Шишкова, А.И. Лазебная, Е.А. Кондратьев, В.Е. Маркова, Л.А. Богданов, А.Е. Тюрина, В.Г. Матвеева – проведение экспериментов; А.Г. Кутихин, Д.К. Шишкова, А.И. Лазебная, Е.А. Кондратьев, А.А. Исаметов, В.Е. Маркова – обсуждение результатов исследования; А.Г. Кутихин и Д.К. Шишкова – написание текста; А.Г. Кутихин – редактирование текста статьи.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда № 22-15-00107‑П «Патологические последствия и молекулярные механизмы воздействия кальций-фосфатных бионов (кальципротеиновых частиц) на форменные элементы крови» (продление), https://rscf.ru/project/22-15-00107/.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Протокол исследования, сбор биоматериала от позвоночных животных и сбор клинических образцов были одобрены Локальным этическим комитетом НИИ КПССЗ (протокол заседания № 5 от 10.04.2023). Исследование было выполнено в соответствии с принципами Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986), с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза по охране животных, используемых в научных целях (согласно рекомендациям Объединения специалистов по работе с лабораторными животными Rus‑LASA), с принципами Хельсинкской декларации (2013) и со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice). До включения в исследование у всех участников было получено письменное информированное согласие.

Список литературы

1. Reid, I. R., Gamble, G. D., and Bolland, M. J. (2016) Circulating calcium concentrations, vascular disease and mortality: a systematic review, J. Intern. Med., 279, 524-540, https://doi.org/10.1111/joim.12464.

2. Rohrmann, S., Garmo, H., Malmström, H., Hammar, N., Jungner, I., Walldius, G., and Van Hemelrijck, M. (2016) Association between serum calcium concentration and risk of incident and fatal cardiovascular disease in the prospective AMORIS study, Atherosclerosis, 251, 85-93, https://doi.org/10.1016/j.atherosclerosis.2016.06.004.

3. Kobylecki, C. J., Nordestgaard, B. G., and Afzal, S. (2021) Plasma ionized calcium and risk of cardiovascular disease: 106,774 individuals from the Copenhagen General Population Study, Clin. Chem., 67, 265-275, https://doi.org/10.1093/clinchem/hvaa24.

4. Torrijo-Belanche, C., Moreno-Franco, B., Muñoz-Cabrejas, A., Calvo-Galiano, N., Casasnovas, J. A., Sayón-Orea, C., and Guallar-Castillón, P. (2024) High serum phosphate is associated with cardiovascular mortality and subclinical coronary atherosclerosis: systematic review and meta-analysis, Nutrients, 16, 1599, https://doi.org/10.3390/nu16111599.

5. Valeriani, E., Pannunzio, A., Palumbo, I. M., Bartimoccia, S., Cammisotto, V., Castellani, V., Porfidia, A., Pignatelli, P., and Violi, F. (2024) Risk of venous thromboembolism and arterial events in patients with hypoalbuminemia: a comprehensive meta-analysis of more than 2 million patients, J. Thromb. Haemost., 22, 2823-2833, https://doi.org/10.1016/j.jtha.2024.06.018.

6. Ronit, A., Kirkegaard-Klitbo, D. M., Dohlmann, T. L., Lundgren, J., Sabin, C. A., Phillips, A. N., Nordestgaard, B. G., and Afzal, S. (2020) Plasma albumin and incident cardiovascular disease: results from the CGPS and an updated meta-analysis, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 40, 473-482, https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.119.313681.

7. Rooney, M. R., Alonso, A., Folsom, A. R., Michos, E. D., Rebholz, C. M., Misialek, J. R., Chen, L. Y., Dudley, S., and Lutsey, P. L. (2020) Serum magnesium and the incidence of coronary artery disease over a median 27 years of follow-up in the ARIC Study and a meta-analysis, Am. J. Clin. Nutr., 111, 52-60, https://doi.org/10.1093/ajcn/nqz256.

8. Larsson, S. C., Burgess, S., and Michaëlsson, K. (2018) Serum magnesium levels and risk of coronary artery disease: Mendelian randomisation study, BMC Med., 16, 68, https://doi.org/10.1186/s12916-018-1065-z.

9. Heiss, A., Eckert, T., Aretz, A., Richtering, W., van Dorp, W., Schäfer, C., and Jahnen-Dechent, W. (2008) Hierarchical role of fetuin-A and acidic serum proteins in the formation and stabilization of calcium phosphate particles, J. Biol. Chem., 283, 14815-14825, https://doi.org/10.1074/jbc.M709938200.

10. Ter Braake, A. D., Shanahan, C. M., and de Baaij, J. H. F. (2017) Magnesium counteracts vascular calcification: passive interference or active modulation? Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 37, 1431-1445, https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.117.309182.

11. Ter Braake, A. D., Vervloet, M. G., de Baaij, J. H. F., and Hoenderop, J. G. J. (2022) Magnesium to prevent kidney disease-associated vascular calcification: crystal clear? Nephrol. Dial. Transplant., 37, 421-429, https://doi.org/10.1093/ndt/gfaa222.

12. Shishkova, D. K., Velikanova, E. A., Bogdanov, L. A., Sinitsky, M. Y., Kostyunin, A. E., Tsepokina, A. V., Gruzdeva, O. V., Mironov, A. V., Mukhamadiyarov, R. A., Glushkova, T. V., Krivkina, E. O., Matveeva, V. G., Hryachkova, O. N., Markova, V. E., Dyleva, Y. A., Belik, E. V., Frolov, A. V., Shabaev, A. R., Efimova, O. S., Popova, A. N., Malysheva, V. Y., Kolmykov, R. P., Sevostyanov, O. G., Russakov, D. M., Dolganyuk, V. F., Gutakovsky, A. K., Zhivodkov, Y. A., Kozhukhov, A. S., Brusina, E. B., Ismagilov, Z. R., Barbarash, O. L., Yuzhalin, A. E., and Kutikhin, A. G. (2021) Calciprotein particles link disturbed mineral homeostasis with cardiovascular disease by causing endothelial dysfunction and vascular inflammation, Int. J. Mol. Sci., 22, 12458, https://doi.org/10.3390/ijms222212458.

13. Кутихин А.Г., Шишкова Д.К., Хрячкова О.Н., Фролов А.В., Шабаев А.Р., Загородников Н.И., Маркова В.Е., Богданов Л.А., Осяев Н.Ю., Индукаева Е.В., Груздева О.В. (2020) Закономерности формирования кальций-фосфатных бионов у пациентов с каротидным и коронарным атеросклерозом, Росс. Кардиол. Журн., 25, 39-48, https://doi.org/10.15829/1560-4071-2022-5064.

14. Шишкова Д.К., Матвеева В.Г., Маркова В.Е., Хрячкова О.Н., Индукаева Е.В., Шабаев А.Р., Фролов А.В., Кутихин А.Г. (2022) Количественная оценка исходной концентрации кальций-фосфатных бионов как скринингового маркера минерального гомеостаза крови у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями и у пациентов с хронической болезнью почек, Росс. Кардиол. Журн., 27, 20-31, https://doi.org/10.15829/1560-4071-2022-5064.

15. Fajol, A., and Faul, C. (2025) Soft tissue calcifications in chronic kidney disease – beyond the vasculature, Pflugers Arch., 477, 1037-1059, https://doi.org/10.1007/s00424-025-03098-0.

16. Hutcheson, J. D., and Goettsch, C. (2023) Cardiovascular calcification heterogeneity in chronic kidney disease, Circ. Res., 132, 993-1012, https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.123.321760.

17. Akhtar, Z., Leung, L. W., Kontogiannis, C., Chung, I., Bin Waleed, K., and Gallagher, M. M. (2022) Arrhythmias in chronic kidney disease, Eur. Cardiol., 17, e05, https://doi.org/10.15420/ecr.2021.52.

18. Moncla, L. M., Briend, M., Bossé, Y., and Mathieu, P. (2023) Calcific aortic valve disease: mechanisms, prevention and treatment, Nat. Rev. Cardiol., 20, 546-559, https://doi.org/10.1038/s41569-023-00845-7.

19. Pasch, A., Farese, S., Gräber, S., Wald, J., Richtering, W., Floege, J., and Jahnen-Dechent, W. (2012) Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum, J. Am. Soc. Nephrol., 23, 1744-1752, https://doi.org/10.1681/ASN.2012030240.

20. Шишкова Д.К., Маркова В.Е., Маркова Ю.О., Торгунакова Е.А., Кондратьев Е.А., Дылева Ю.А., Кутихин А.Г. (2024) Закономерности распределения кальция по биохимическим компартментам сыворотки крови при моделировании минерального стресса in vitro в контексте дисфункции эндотелия, Компл. Пробл. Серд. Сосуд. Забол., 13, 60-71, https://doi.org/10.17802/2306-1278-2024-13-2-60-71.

21. Shishkova, D., Markova, V., Markova, Y., Sinitsky, M., Sinitskaya, A., Matveeva, V., Torgunakova, E., Lazebnaya, A., Stepanov, A., and Kutikhin, A. (2025) Physiological concentrations of calciprotein particles trigger activation and pro-inflammatory response in endothelial cells and monocytes, Biochemistry (Moscow), 90, 132-160, https://doi.org/10.1134/S0006297924604064.

22. Шишкова Д.К., Маркова В.Е., Маркова Ю.О., Великанова Е.А., Синицкая А.В., Синицкий М.Ю., Тюрина А.Е., Степанов А.Д., Дылева Ю.А., Матвеева В.Г., Кутихин А.Г. (2024) Исследование патологического воздействия ионизированного кальция, кальципротеиновых мономеров и кальципротеиновых частиц на первичные артериальные эндотелиальные клетки, Компл. Пробл. Серд. Сосуд. Забол., 13, 167-181, https://doi.org/10.17802/2306-1278-2024-13-3-167-181.

23. Koeppert, S., Ghallab, A., Peglow, S., Winkler, C. F., Graeber, S., Büscher, A., Hengstler, J. G., and Jahnen-Dechent, W. (2021) Live imaging of calciprotein particle clearance and receptor mediated uptake: role of calciprotein monomers, Front. Cell Dev. Biol., 9, 633925, https://doi.org/10.3389/fcell.2021.633925.

24. Mencke, R., Al Ali, L., de Koning, M. L. Y., Pasch, A., Minnion, M., Feelisch, M., van Veldhuisen, D. J., van der Horst, I. C. C., Gansevoort, R. T., Bakker, S. J. L., de Borst, M. H., van Goor, H., van der Harst, P., Lipsic, E., and Hillebrands, J. L. (2024) Serum calcification propensity is increased in myocardial infarction and hints at a pathophysiological role independent of classical cardiovascular risk factors, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 44, 1884-1894, https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.124.320974.

25. Bundy, J. D., Cai, X., Mehta, R. C., Scialla, J. J., de Boer, I. H., Hsu, C. Y., Go, A. S., Dobre, M. A., Chen, J., Rao, P. S., Leonard, M. B., Lash, J. P., Block, G. A., Townsend, R. R., Feldman, H. I., Smith, E. R., Pasch, A., Isakova, T., and CRIC Study Investigators (2019) Serum calcification propensity and clinical events in CKD, Clin. J. Am. Soc. Nephrol., 14, 1562-1571, https://doi.org/10.2215/CJN.04710419.

26. Eelderink, C., Te Velde-Keyzer, C. A., Frenay, A. S., Vermeulen, E. A., Bachtler, M., Aghagolzadeh, P., van Dijk, P. R., Gansevoort, R. T., Vervloet, M. G., Hillebrands, J. L., Bakker, S. J. L., van Goor, H., Pasch, A., de Borst, M. H., and NIGRAM2+ consortium (2020) Serum calcification propensity and the risk of cardiovascular and all-cause mortality in the general population: the PREVEND Study, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 40, 1942-1951, https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.120.314187.

27. Miura, Y., Iwazu, Y., Shiizaki, K., Akimoto, T., Kotani, K., Kurabayashi, M., Kurosu, H., and Kuro-O, M. (2018) Identification and quantification of plasma calciprotein particles with distinct physical properties in patients with chronic kidney disease, Sci. Rep., 8, 1256, https://doi.org/10.1038/s41598-018-19677-4.

28. Smith, E. R., Hewitson, T. D., Cai, M. M. X., Aghagolzadeh, P., Bachtler, M., Pasch, A., and Holt, S. G. (2017) A novel fluorescent probe-based flow cytometric assay for mineral-containing nanoparticles in serum, Sci. Rep., 7, 5686, https://doi.org/10.1038/s41598-017-05474-y.

29. Feenstra, L., Reijrink, M., Pasch, A., Smith, E. R., Visser, L. M., Bulthuis, M., Lodewijk, M. E., Mastik, M. F., Greuter, M. J. W., Slart, R. H. J. A., Mulder, D. J., Pol, R. A., Te Velde-Keyzer, C. A., Krenning, G., Hillebrands, J. L., and TransplantLines Investigators (2024) Calciprotein particle counts associate with vascular remodelling in chronic kidney disease, Cardiovasc. Res., 120, 1953-1966, https://doi.org/10.1093/cvr/cvae164.

30. Chen, W., Anokhina, V., Dieudonne, G., Abramowitz, M. K., Kashyap, R., Yan, C., Wu, T. T., de Mesy Bentley, K. L., Miller, B. L., and Bushinsky, D. A. (2019) Patients with advanced chronic kidney disease and vascular calcification have a large hydrodynamic radius of secondary calciprotein particles, Nephrol. Dial. Transplant., 34, 992-1000, https://doi.org/10.1093/ndt/gfy117.