Исследование внутригеномного полиморфизма внутренних транскрибируемых спейсеров генов 35S рРНК – верификация гипотезы о гибридогенном происхождении тетраплоидного вида Pulsatilla vulgaris

Аннотация

Pulsatilla vulgaris – редкий и исчезающий вид растений. Методом секвенирования ДНК-штрихкода ITS1‑5.8S рДНК‑ITS2 и локус-специфичного NGS-секвенирования спейсера ITS1 изучен внутривидовой и межвидовой полиморфизм локусов 35S рДНК и исследовано происхождение редкого охраняемого тетраплоидного вида P. vulgaris из уникальной российской популяции. Впервые определено число хромосом в кариотипе растений из этой популяции, 2n = 32. Показано, что одним из родительских видов этого тетраплоида является диплоидный вид Pulsatilla patens (2n = 16), а второй родительский вид остается неизвестным, хотя и близким к диплоидному Pulsatilla pratensis.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Вклад авторов

Е.О. Пунина, А.В. Гнутиков, А.В. Родионов – концепция и руководство работой; Е.О. Пунина и А.А. Гнутиков – сбор материала; А.А. Гнутиков и Н.Н. Носов – проведение работ по выделению ДНК и подготовке к секвенированию; А.А. Гнутиков, Н.Н. Носов и Е.О. Пунина – обработка результатов секвенирования ДНК; Е.О. Пунина, А.В. Родионов и В.С. Шнеер – обсуждение результатов исследования, написание и редактирование статьи.

Финансирование

Работа выполнена на средства Госзадания 124020100136-0.

Благодарности

В работе использовали оборудование ЦКП «Клеточные и молекулярные технологии изучения растений и грибов» БИН РАН и ЦКП ВНИИ Сельскохозяйственной микробиологии. Авторы благодарят анонимного рецензента, чьи замечания позволили значительно улучшить текст статьи.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Rogers, S. O., and Bendich, A. J. (1987) Ribosomal RNA genes in plants: variability in copy number and in the intergenic spacer, Plant Mol. Biol., 9, 509-520, https://doi.org/10.1007/BF00015882.

2. Rodionov, A. V., Gnutikov, A. A., Kotsinyan, A. R., Kotseruba, V. V., Nosov, N. N., Punina, E. O., Rayko, M.P., Tyupa, N. B., and Kim, E. S. (2017) ITS1-5.8S rDNA-ITS2 sequence in 35S rRNA genes as marker during reconstruction of phylogeny of cereals (Poaceae family), Biol. Bull. Rev., 7, 85-102, https://doi.org/10.1134/S2079086417020062.

3. Shneyer, V. S., and Rodionov, A. V. (2019) Plant DNA barcodes, Biol. Bull. Rev., 9, 295-300, https://doi.org/10.7868/S0042132418060017.

4. Ganley, A. R., and Kobayashi, T. (2007) Highly efficient concerted evolution in the ribosomal DNA repeats: total rDNA repeat variation revealed by whole-genome shotgun sequence data, Genome Res., 17, 184-191, https://doi.org/10.1101/gr.5457707.

5. Eickbush, T. H., and Eickbush, D. G. (2007) Finely orchestrated movements: evolution of the ribosomal RNA genes, Genetics, 175, 477-485, https://doi.org/10.1534/genetics.107.071399.

6. Kovarik, A., Dadejova, M., Lim, Y. K., Chase, M. W., Clarkson, J. J., Knapp, S., and Leitch A. R. (2008) Evolution of rDNA in Nicotiana allopolyploids: a potential link between rDNA homogenization and epigenetics, Ann. Bot., 101, 815-823, https://doi.org/10.1093/aob/mcn019.

7. Zhang, M., Tang, Y. W., Xu, Y., Yonezawa, T., Shao, Y., Wang, Y. G., Song, Z. P., Yang, J., and Zhang, W. J. (2021) Concerted and birth-and-death evolution of 26S ribosomal DNA in Camellia L., Ann. Bot., 127, 63-73, https://doi.org/10.1093/aob/mcaa169.

8. Matyášek, R., Renny-Byfield, S., Fulneček, J., Macas, J., Grandbastien, M.-A., Nichols, R., Leitch, A., and Kovařík, A. (2012) Next generation sequencing analysis reveals a relationship between rDNA unit diversity and locus number in Nicotiana diploids, BMC Genom., 13, 722, https://doi.org/10.1186/1471-2164-13-722.

9. Belyakov, E. A., Mikhaylova, Y. V., Machs, E. M., Zhurbenko, P. M., and Rodionov, A. V. (2022) Hybridization and diversity of aquatic macrophyte Sparganium L. (Typhaceae) as revealed by high-throughput nrDNA sequencing, Sci. Rep., 12, 21610, https://doi.org/10.1038/s41598-022-25954-0.

10. Sang, T., Crawford, D. J., and Stuessy, T. F. (1995) Documentation of reticulate evolution in peonies (Paeonia) using internal transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal DNA: implications for biogeography and concerted evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 6813-6817, https://doi.org/10.1073/pnas.92.15.6813.

11. Punina, E. O., Machs, E. M., Krapivskaya, E. E., Kim, E. S., Mordak, E. V., Myakoshina, Y. A., and Rodionov, A. V. (2012) Interspecific hybridization in the genus Paeonia (Paeoniaceae): polymorphic sites in transcribed spacers of the 45S rRNA genes as indicators of natural and artificial peony hybrids, Russ. J. Genet., 48, 684-697, https://doi.org/10.1134/S1022795417010112.

12. Punina, E. O., Machs, E. M., Krapivskaya, E. E., and Rodionov, A. V. (2017) Polymorphic sites in transcribed spacers of 35S rRNA genes as an indicator of origin of the Paeonia cultivars, Russ. J. Genet., 53, 202-212, https://doi.org/10.1134/S1022795417010112.

13. Kotseruba, V., Pistrick, K., Blattner, F. R., Kumke, K., Weiss, O., Rutten, T., Fuchs J., Endo T., Nasuda S., Ghukasyan, A., and Houben, A. (2010) The evolution of the hexaploid grass Zingeria kochii (Mez) Tzvel. (2n=12) was accompanied by complex hybridization and uniparental loss of ribosomal DNA, Mol. Phyl. Evol., 56, 146-155, https://doi.org/10.1016/j.ympev.2010.01.003.

14. Kita, Y., and Ito, M. (2000) Nuclear ribosomal ITS sequences and phylogeny in East Asian Aconitum subgenus Aconitum (Ranunculaceae), with special reference to extensive polymorphism in individual plants, Plant Syst. Evol., 225, 1-13, https://doi.org/10.1007/BF00985455.

15. Grigoryan, M. Y., Bobrov, A. A., Brunton, D. F., Volkova, P. A., Logacheva, M. D., and Neretina, T. V. (2021) Next generation DNA sequencing reveals allopolyploid origin of decaploid Isoëtes lacustris (Isoëtaceae), Aquat. Bot., 170, 103326, https://doi.org/10.1016/j.aquabot.2020.103326.

16. Krak, K., Caklová, P., Kopecký, D., Blattner, F. R., and Mahelka, V. (2021) Horizontally acquired nrDNAs persist in low amounts in host Hordeum genomes and evolve independently of native nrDNA, Front. Plant Sci., 12, 672879, https://doi.org/10.3389/fpls.2021.672879.

17. Gnutikov, A. A., Nosov, N. N., Loskutov, I. G., Blinova, E. V., Shneyer, V. S., and Rodionov, A. V. (2023) Origin of wild polyploid Avena species inferred from polymorphism of the ITS1 rDNA in their genomes, Diversity, 15, 717, https://doi.org/10.3390/d15060717.

18. Gnutikov, A. A., Nosov, N. N., Punina, E. O., Loskutov, I. G., Shneyer, V. S., Chekrygin, S. A., and Rodionov, A. V. (2024) Hybridization in the subtribe Alopecurinae Dumort (Poaceae) according to molecular phylogenetic analysis: different ploidy level tells different origin of the groups, Plants, 13, 919, https://doi.org/10.3390/plants13070919.

19. Gnutikov, A. A., Nosov, N. N., Loskutov, I. G., Rodionov, A. V., and Shneyer, V. S. (2025) Participation of wild species genus Avena L. (Poaceae) of different ploidy in the origin of cultivated species according to data on intragenomic polymorphism of the ITS1-5.8S rRNA region, Plants, 14, 1550, https://doi.org/10.3390/plants14101550.

20. Пунина Е. О., Мачс Э. М., Носов Н. Н., Гнутиков А. А., Родионов А. В. (2023) NGS-секвенирование (Illumina) как инструмент для определения геномного состава и таксономической принадлежности видов и межвидовых гибридов на примере злаков трибы Ячменевых (Hordeeae), Пробл. Бот. Южной Сибири Монголии, 22, 276-286.

21. Punina, E. O., Gnutikov, A. A., Nosov, N. N., Shneyer, V. S., and Rodionov, A. V. (2024) Hybrid origin of Leymotrigia bergrothii (Poaceae) as revealed by analysis of the internal transcribed spacer ITS1 and trnL sequences, Int. J. Mol. Sci., 25, 11966, https://doi.org/10.3390/ijms252211966.

22. Punina, E. O., Mikhaylova, Y. V., Shneyer, V. S., Krapivskaya, E. E., Machs, E. M., and Rodionov, A. V. (2024) Intragenomic polymorphism of the 35S rDNA internal transcribed spacers (ITS) in three species and three interspecific hybrids of Pulsatilla (Ranunculaceae), Turczaninowia, 27, 67-85, https://doi.org/10.14258/turczaninowia.27.4.8.

23. Łaska, G., Sienkiewicz, A., Stocki, M., Zjawiony, J. K., Sharma, V., Bajguz, A., Piotrowska-Niczyporuk, A., Jacob, M., and Khan, S. (2019) Phytochemical screening of Pulsatilla species and investigation of their biological activities, Acta Soc. Bot. Pol., 88, 3613, https://doi.org/10.5586/asbp.3613.

24. Цвелев, Н. Н. (1976) Флористические новинки в Ленинградской области, Новости Системат. Высш. Раст., 13, 278-284.

25. Sorokina, I. A., Volkova, E. A., Khramtsov, V. N., Philippova, A. V., Leostrin, A. V., Gagarina, L. V., Himelbrant, D. E., Koptseva, E. M., Kurbatova, L. E., and Stepanchikova, I. S. (2024) Pulsatilla vulgaris (Ranunculaceae) conservation in Russia: habitat management to enhance the only population, Bot. Zhurn., 109, 908-929, https://doi.org/10.31857/S0006813624090068.

26. Красная книга Российской Федерации, Растения и грибы (2024) Отв. ред. Д.В. Гельтман, 2-е офиц. изд., Москва, ВНИИ «Экология», 944 с.

27. Walker, K., and Pinches, C. (2011) Reduced grazing and the decline of Pulsatilla vulgaris Mill. (Ranunculaceae) in England, UK, Biol. Conserv., 144, 3098-3105, https://doi.org/10.1016/j.biocon.2011.10.006.

28. Wojtowicz, W. (2001) Pulsatilla vulgaris Mill. Sasanka zwyczajana, Polska czerwona ksiega roslin, Krakow, 138-139.

29. Essl F. (2005) Population development, vegetation connection and threat situation of the common pasqueflower (Pulsatilla vulgaris Mill.) in Austria from 1991-2005 [in German], Linz. Biol. Beitrage, 37, 1145-1176.

30. Schweizer, F., and Hasinger, O. (2014) Pulsatilla vulgaris. The IUCN red list of threatened species 2014: e.T161913A50786112, https://doi.org/10.2305/IUCN.UK.2014-1.RLTS.T161913A50786112.en.

31. Hoot, S. B., Meyer, K. M., and Manning, J. C. (2012) Phylogeny and reclassification of Anemone (Ranunculaceae), with an emphasis on austral species, Syst. Bot., 37, 139-152, https://doi.org/10.1600/036364412X616729.

32. Sramkó, G., Laczkó, L., Volkova, P. A., Bateman, R. M., and Mlinarec, J. (2019) Evolutionary history of the Pasque-flowers (Pulsatilla, Ranunculaceae): Molecular phylogenetics, systematics and rDNA evolution, Mol. Phylogenet. Evol., 135, 45-61, https://doi.org/10.1016/j.ympev.2019.02.015.

33. Baumberger, H. (1971) Chromosome number determinations and karyotype analyses in the genera Anemone, Hepatica and Pulsatilla [in German], Ber. Schweiz. Bot. Ges., 80, 17-95.

34. Tamura, M. (1995) II. Systematic Part. In: Hiepko, P. (Ed.), The Natural Plant Families with their Genera and Most Important Species, in particular the Useful Plants. Volume 17a IV. Angiospermae: Order Ranunculales, Family Ranunculaceae. Duncker & Humboldt, Berlin, pp. 223-519.

35. Крогулевич Р. Е. (1978) Кариологический анализ видов флоры Восточного Саяна, в книге Флора Прибайкалья, Новосибирск, Наука, с. 19-48.

36. Böcher, T. W. (1934) Contributions to the cytology of the genus Anemone [in German], Bot. Tidsskrift., 42, 183-206.

37. Ridgway, K. P., Duck, J. M., and Young, J. P. W. (2003) Identification of roots from grass swards using PCR-RFLP and FFLP of the plastid trnL (UAA) intron, BMC Ecol., 3, 3-8, https://doi.org/10.1186/1472-6785-3-8.

38. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., and Taylor, J. (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, in PCR Protocols: Guide to Methods and Applications (Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. I., White, T. J., eds) San Diego, Academic Press, pp. 315-322, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-372180-8.50042-1.

39. Kumar, S., Stecher, G., Suleski, M., Sanderford, M., Sharma, S., and Tamura, K. (2024) MEGA 12: molecular evolutionary genetics analysis version 12 for adaptive and green computing, Mol. Biol. Evol., 41, 1-9, https://doi.org/10.1093/molbev/msae263.

40. Ronquist, F., Teslenko, M., van der Mark, P., Ayres, D. L., Darling, A., Hohna, S., Larget, B., Liu, L., Suchard, M. A., and Huelsenbeck, J. P. (2012) MrBayes 3.2: efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model space, Syst. Biol., 61, 539-542, https://doi.org/10.1093/sysbio/sys029.

41. Zhumabay, N., Sutula, M., Ishmuratova, M. Y., Bekkuzhina, S., and Manabayeva, S. (2025). Molecular phylogenetic analysis of the Ranunculaceae family plants based on DNA barcoding in the Karaganda region flora, Eur. J. Appl. Biotechnol., 1, 40-50, https://doi.org/10.11134/btp.1.2025.5.

42. Minh, B. Q., Schmidt, H. A., Chernomor, O., Schrempf, D., Woodhams, M. D., von Haeseler, A., and Lanfear, R. (2020) IQ-TREE 2: new models and efficient methods for phylogenetic inference in the Genomic Era, Mol. Biol. Evol., 37, 1530-1534, https://doi.org/10.1093/molbev/msaa015.

43. Bolger, A.M., Lohse, M., and Usadel, B. (2014) Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data, Bioinformatics, 30, 2114-2120, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btu170.

44. Okonechnikov, K., Golosova, O., and Fursov, M. (2012) Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit, Bioinformatics, 28, 1166-1167, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts091.

45. Rognes, T., Flouri, T., Nichols, B., Quince, C., and Mahe, F. (2016) VSEARCH: A versatile open source tool for metagenomics, Peer J., 4, e2584, https://doi.org/10.7717/peerj.2584.

46. Edgar, R. C. (2016) UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing, bioRxiv, https://doi.org/10.1101/081257.

47. Clement, M., Posada, D., and Crandall, K. A. (2000) TCS: A computer program to estimate gene genealogies, Mol. Ecol., 9, 1657-1660, https://doi.org/10.1046/j.1365-294x.2000.01020.x.

48. Múrias dos Santos, A., Cabezas, M. P., Tavares, A. I., Xavier, R., and Branco, M. (2016) tcsBU: A tool to extend TCS network layout and visualization, Bioinformatics, 32, 627-628, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btv636.

49. Xiang, K. L., Cao, G. L., Peng, H. W., Li, X. Q., Erst, A. S., Lian, L., Erst, T. V., Jabbour, F., Ortiz, R. D. C., and Wang, W. (2025) Molecular phylogeny of Anemone (Ranunculaceae), with special emphasis on the origin of alpine species, Taxon, 74, 292-306, https://doi.org/10.1002/tax.13297.

50. Li, Q. J., Wang, X., Wang, J. R., Su, N., Zhang, L., Ma, Y. P., Chang, Z. Y., Zhao, L., and Potter, D. (2019) Efficient identification of Pulsatilla (Ranunculaceae) using DNA barcodes and micro-morphological characters, Front. Plant Sci., 10, 1196, https://doi.org/10.3389/fpls.2019.01196.

51. Forrest, L. L., Bell, D., and Hart, M. (2023) DNA barcoding standard operating protocol, Plants and Lichens at RBGE, Sample Data, https://doi.org/10.17504/protocols.io.e6nvwjzr9lmk/v1.

52. Mlinarec, J., Šatović, Z., Malenica, N., Ivančić-Baće, I., and Besendorfer, V. (2012) Evolution of the tetraploid Anemone multifida (2n = 32) and hexaploid A. baldensis (2n = 48) (Ranunculaceae) was accompanied by rDNA loci loss and intergenomic translocation: evidence for their common genome origin, Ann. Bot., 110, 703-712, https://doi.org/10.1093/aob/mcs128.

53. Kuzmina, M. L., Braukmann, T. W. A., Fazekas, A. J., Graham, S. W., Dewaard, S. L., Rodrigues, A., Bennett, B. A., Dickinson, T. A., Saarela, J. M., Catling, P. M., Newmaster, S. G., Percy, D. M., Fenneman, E., Lauron-Moreau, A., Ford, B., Gillespie, L., Subramanyam, R., Whitton, J., Jennings, L., Metsger, D., Warne, C. P., Brown, A., Sears, E., Dewaard, J. R., Zakharov, E. V., and Hebert, P. D. N. (2017) Using herbarium‐derived DNAs to assemble a large‐scale DNA barcode library for the vascular plants of Canada, Appl. Plant Sci., 5, 1700079, https://doi.org/10.3732/apps.1700079.

54. Pfosser, M., Sun, B. Y., Stuessy, T. F., Jang, C. G., Guo, Y. P., Taejin, K., Hwan, K. C., Kato, H., and Sugawara, T. (2011) Phylogeny of Hepatica (Ranunculaceae) and origin of Hepatica maxima Nakai endemic to Ullung Island, Korea, Biol. J. Linnean Soc., 95, 16-27.

55. Kwon, E., Kim, J. Y., Chang, M., Lee, M., Moon, S., and Lee, W. H. (2022) Identification of 19 Species of poisonous plants from Jeju Island and construction of a database using DNA-barcoding, Kor. J. Plant Res., 35, 346-361, https://doi.org/10.7732/kjpr.2022.35.2.346.

56. Gulyás, G., Sramkó, G., Molnár, V.A., Rudnóy, S., Illyés, Z., Balázs, T., and Bratek, Z. (2005) Nuclear ribosomal DNA ITS paralogs as evidence of recent interspecific hybridization in the genus Ophrys (Orchidaceae), Acta Biol. Cracov. Ser. Bot., 47, 61-67.