Внутренний промотор и сайты связывания микроРНК в кодирующей области: особенности регуляции эволюционно молодого гена lawc у Drosophila melanogaster

Аннотация

Влияние микроРНК (миРНК) на экспрессию консервативных генов хорошо известно, однако нет сведений об их вкладе в контроль работы эволюционно молодых генов. Ген lawc возник de novo в 5′‑нетранслируемой области гена Trf2. Мы использовали модельную систему этих генов с целью оценить возможную роль миРНК как инструмента эволюционной адаптации, обеспечивающего согласованную работу генов в условиях их перекрытия. Исследование включало применение трансгенных линий дрозофил с индуцибельной экспрессией предшественников миРНК (miR‑4968, miR‑2491, miR‑13b‑1), а также созданного GFP‑сенсора, позволяющего визуализировать подавление экспрессии целевых последовательностей под действием миРНК in vivo. Для тканеспецифической активации трансгенов использовали дрожжевую двухкомпонентную систему Gal4/UAS. Люциферазный тест на культурах клеток Drosophila S2 и человека HEK293 применяли для подтверждения функциональности уникального промотора, предсказанного внутри кодирующей области (CDS) гена lawc, и оценки влияния миРНК на его экспрессию в клетках S2. Дополнительно проводили иммуноблоттинг, ОТ‑ПЦР и конфокальную микроскопию для анализа уровня белка и мРНК, а также визуализацию активности GFP-сенсора в тканях дрозофилы. Полученные данные позволили экспериментально подтвердить функциональность внутреннего промотора гена lawc и роль исследуемых миРНК схожего эволюционного возраста в модуляции его экспрессии. На примере гена lawc мы заключили, что промоторы в составе CDS характерны не только для генов микроорганизмов и дрожжей, но могут встречаться и у эволюционно молодых генов высших эукариот, возникших в регуляторной зоне другого гена. Примечательно, что эти гены быстро приобретают регуляцию миРНК схожего эволюционного возраста, что указывает на ко-эволюционный механизм, лежащий в основе формирования новых регуляторных сетей, обеспечивающих адаптацию двух генов в условиях их перекрытия.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Дополнительные материалы

Приложение

Вклад авторов

О.Б. Симонова – концепция и руководство работой; О.Б. Симонова и Е.Л. Заволока – проведение экспериментов; О.Б. Симонова, Г.П. Георгиев, Е.Л. Заволока – обсуждение результатов исследования; О.Б. Симонова – написание текста; О.Б. Симонова и Г.П. Георгиев – редактирование текста статьи.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 24-24-00354).

Благодарности

Авторы благодарны Bloomington Drosophila Stock Center (Индиана, США) и коллекционному центру «FlyORF» (Цюрих, Швейцария) за предоставление линий дрозофил. Авторы благодарны проф. Конраду Баслеру (Konrad Basler, Institute of Molecular Biology, University of Zurich) и его сотрудникам за предоставление вектора pUAST-eGFPattB. Авторы также выражают благодарность Р.О. Черезову, Ю.Е. Воронцовой (Институт биологии гена РАН), Д.Ю. Пантелееву (Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН) за консультацию при постановке экспериментов, а также Арсену Микоэляну (Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова) за помощь в проведении денсометрического анализа. Работу выполняли с использованием УНУ ИБГ РАН «Коллекция геноредактированных линий дрозофил» и инфраструктуры ИБГ РАН.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Bartel, D. P. (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function, Cell, 116, 281-297, https://doi.org/10.1016/s0092-8674(04)00045-5.

2. Vilgelm, A. E., Chumakov, S. P., and Prassolov, V. S. (2006) RNA interference: biology and prospects of application in biomedicine and biotechnology, Mol. Biol., 40, 339-354, https://doi.org/10.1134/S0026893306030010.

3. O’Brien, J., Hayder, H., Zayed, Y., and Peng, C. (2018) Overview of microRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation, Front. Endocrinol., 9, 402, https://doi.org/10.3389/fendo.2018.00402.

4. Alberti, C., and Cochella, L. (2017) A framework for understanding the roles of miRNAs in animal development, Development, 144, 2548-2559, https://doi.org/10.1242/dev.146613.

5. Takasaki, S. (2015) Roles of microRNAs in cancers and development, Methods Mol. Biol., 1218, 375-413, https://doi.org/10.1007/978-1-4939-1538-5_24.

6. Ruby, J. G., Stark, A., Johnston, W. K., Kellis, M., Bartel, D. P., and Lai, E. C. (2007) Evolution, biogenesis, expression, and target predictions of a substantially expanded set of Drosophila microRNAs, Genome Res., 17, 1850-1864, https://doi.org/10.1101/gr.6597907.

7. Chawla, G., Luhur, A., and Sokol, N. (2016) Analysis of microRNA function in Drosophila, Drosophila, 79-94, https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6371-3_4.

8. Pinzón, N., Li, B., Martinez, L., Sergeeva, A., Presumey, J., Apparailly, F., and Seitz, H. (2017) microRNA target prediction programs predict many false positives, Genome Res., 27, 234-245, https://doi.org/10.1101/gr.205146.116.

9. Riffo-Campos, Á. L., Riquelme, I., and Brebi-Mieville, P. (2016) Tools for sequence-based miRNA target prediction: what to choose? Int. J. Mol. Sci., 17, 1987, https://doi.org/10.3390/ijms17121987.

10. Cherezov, R. O., Vorontsova, J. E., Kuvaeva, E. E., Akishina, A. A., Zavoloka, E. L., and Simonova, O. B. (2025) The lawc gene emerged de novo from conserved genomic elements and acquired a broad expression pattern in Drosophila, J. Genet. Genomics, 52, 901-914, https://doi.org/10.1016/j.jgg.2024.12.014.

11. Davidson, I. (2003) The genetics of TBP and TBP-related factors, Trends Biochem. Sci., 28, 391-398, https://doi.org/10.1016/S0968-0004(03)00117-8.

12. Kopytova, D. V., Krasnov, A. N., Kopantceva, M. R., Nabirochkina, E. N., Nikolenko, J. V., Maksimenko, O., Kurshakova, M. M., Lebedeva, L. A., Yerokhin, M. M., Simonova, O. B., Korochkin, L. I., Tora, L., Georgiev, P. G., and Georgieva, S. G. (2006) Two isoforms of Drosophila TRF2 are involved in embryonic development, premeiotic chromatin condensation and proper differentiation of germ cells of both sexes, Mol. Cell Biol., 26, 7492-74505, https://doi.org/10.1128/MCB.00349-06.

13. Cherezov, R. O., Vorontsova, J. E., and Simonova, O. B. (2020) TBP-related factor 2 as a trigger for Robertsonian translocations and speciation, Int. J. Mol. Sci., 21, 8871, https://doi.org/10.3390/ijms21228871.

14. Cherezov, R. O., Vorontsova, Yu. E., Mertsalov, I. B., Kulikova, D. A., and Simonova, O. B. (2013) The influence of hairpin RNA against lawc, on the expression of overlapping genes of the lawc/Trf2 complex in D. melanogaster, Biol. Bull., 40, 119-123, https://doi.org/10.1134/S1062359013020040.

15. Schertel, C., Rutishauser, T., Förstemann, K., and Basler, K. (2012) Functional characterization of Drosophila microRNAs by a novel in vivo library, Genetics, 192, 1543-1552, https://doi.org/10.1534/genetics.112.145383.

16. Horwich, M. D., and Zamore, P. D. (2008) Design and delivery of antisense oligonucleotides to block microRNA function in cultured Drosophila and human cells, Nat. Protoc., 3, 1537-1549, https://doi.org/10.1038/nprot.2008.145.

17. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., and Basler, K. (2007) An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific φC31 integrases, PNAS, 104, 3312-3317, https://doi.org/10.1073/pnas.0611511104.

18. Brand, A. H., and Perrimon, N. (1993) Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes, Development, 118, 401-415, https://doi.org/10.1242/dev.118.2.401.

19. Vorontsova, J. E., Akishina, A. A., Cherezov, R. O., and Simonova, O. B. (2023) A new insight into the aryl hydrocarbon receptor/cytochrome 450 signaling pathway in MG63, HOS, SAOS2, and U2OS cell lines, Biochimie, 207, 102-112, https://doi.org/10.1016/j.biochi.2022.10.018.

20. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J. Y., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P., and Cardona, A. (2012) Fiji: an open-source platform for biological-image analysis, Nat. Methods, 9, 676-682, https://doi.org/10.1038/nmeth.2019.

21. Tastsoglou, S., Alexiou, A., Karagkouni, D., Skoufos, G., Zacharopoulou, E., and Hatzigeorgiou, A. G. (2023) DIANA-microT 2023: including predicted targets of virally encoded miRNAs, Nucleic Acids Res., 51, W148-W153, https://doi.org/10.1093/nar/gkad283.

22. Lee, B. B., Woo, H., Lee, M. K., Youn, S., Lee, S., Roe, J. S., Lee, S. Y., and Kim, T. (2021) Core promoter activity contributes to chromatin-based regulation of internal cryptic promoters, Nucleic Acids Res., 49, 8097-8109, https://doi.org/10.1093/nar/gkab639.

23. Wright, B. W., Molloy, M. P., and Jaschke, P. R. (2022) Overlapping genes in natural and engineered genomes, Nat. Rev. Genet., 23, 154-168, https://doi.org/10.1038/s41576-021-00417-w.

24. Wang, Y., Yue, X. J., Yuan, S. F., Hong, Y., Hu, W. F., and Li, Y. Z. (2021) Internal promoters and their effects on the transcription of operon genes for epothilone production in Myxococcus xanthus, Front. Bioeng. Biotechnol., 9, 758561, https://doi.org/10.3389/fbioe.2021.758561.

25. Hua, C., Huang, J., Wang, T., Sun, Y., Liu, J., Huang, L., and Deng, X. (2022) Bacterial transcription factors bind to coding regions and regulate internal cryptic promoters, mBio, 13, e01643-22, https://doi.org/10.1128/mbio.01643-22.

26. Rawal, Y., Chereji, R. V., Valabhoju, V., Qiu, H., Ocampo, J., Clark, D. J., and Hinnebusch, A. G. (2018) Gcn4 binding in coding regions can activate internal and canonical 5′ promoters in yeast, Mol. Cell, 70, 297-311, https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.03.007.

27. Han, B., and Zhang, J. T. (2002) Regulation of gene expression by internal ribosome entry sites or cryptic promoters: the eIF4G story, Mol. Cell Biol., 22, 7372-7384, https://doi.org/10.1128/MCB.22.21.7372-7384.2002.

28. Akirtava, C., May, G. E., and McManus, C. J. (2022) False-positive IRESes from Hoxa9 and other genes resulting from errors in mammalian 5′ UTR annotations, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 119, e2122170119, https://doi.org/10.1073/pnas.2122170119.

29. Lu, Z., Liu, Y., Ren, Z., and Yan, J. (2016) PRDM8 internal promoter hyperhydroxymethylation correlates with increased expression of the corresponding transcript in Down syndrome, Mol. Med. Rep., 14, 1227-1234, https://doi.org/10.3892/mmr.2016.5375.

30. White, R. J. (2011) Transcription by RNA polymerase III: more complex than we thought, Nat. Rev. Genet., 12, 459-463, https://doi.org/10.1038/nrg3001.

31. Carninci, P., Sandelin, A., Lenhard, B., Katayama, S., Shimokawa, K., Ponjavic, J., Semple, C. A., Taylor, M. S., Engström, P. G., Frith, M. C., Forrest, A. R., Alkema, W. B., et al. (2006) Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution, Nat. Genet., 38, 626-635, https://doi.org/10.1038/ng1789.

32. Andersson, R., Sandelin, A. (2019) Determinants of enhancer and promoter activities of regulatory elements, Nat. Rev. Genet., 21, 71-87, https://doi.org/10.1038/s41576-019-0173-8.

33. Li, Q., Liu, X., Wen, J., Chen, X., Xie, B., and Zhao, Y. (2023) Enhancer RNAs: mechanisms in transcriptional regulation and functions in diseases, Cell Commun. Signal., 21, 191, https://doi.org/10.1186/s12964-023-01206-0.

34. Mikhaylichenko, O., Bondarenko, V., Harnett, D., Schor, I. E., Males, M., Viales, R. R., and Furlong, E. E. M. (2018) The degree of enhancer or promoter activity is reflected by the levels and directionality of eRNA transcription, Genes Dev., 32, 42-57, https://doi.org/10.1101/gad.308619.117.

35. Mohammed, J., Flynt, A. S., Panzarino, A. M., Mondal, M. M. H., DeCruz, M., Siepel, A., and Lai, E. C. (2018) Deep experimental profiling of microRNA diversity, deployment, and evolution across the Drosophila genus, Genome Res., 28, 52-65, https://doi.org/10.1101/gr.226068.117. Erratum in: Genome Res., 29, 881, https://doi.org/10.1101/gr.250654.119.

36. Bartel, D. P. (2018) Metazoan microRNAs, Cell, 173, 20-51, https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.03.006.

37. Tay, Y., Zhang, J., Thomson, A. M., Lim, B., and Rigoutsos, I. (2008) MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation, Nature, 455, 1124-1128, https://doi.org/10.1038/nature07299. Erratum in: Nature, 2009, 458, 538.

38. Hausser, J., Syed, A. P., Bilen, B., and Zavolan, M. (2013) Analysis of CDS-located miRNA target sites suggests that they can effectively inhibit translation, Genome Res., 23, 604-615, https://doi.org/10.1101/gr.139758.112.

39. Jonas, S., and Izaurralde, E. (2015) Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing, Nat. Rev. Genet., 16, 421-433, https://doi.org/10.1038/nrg3965.

40. Dexheimer, P. J., and Cochella, L. (2020) MicroRNAs: from mechanism to organism, Front. Cell Dev. Biol., 8, 409, https://doi.org/10.3389/fcell.2020.00409.

41. Schnall-Levin, M., Zhao, Y., Perrimon, N., and Berger, B. (2010) Conserved microRNA targeting in Drosophila is as widespread in coding regions as in 3′UTRs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107, 15751-15756, https://doi.org/10.1073/pnas.1006172107.

42. Schnall-Levin, M., Rissland, O. S., Johnston, W. K., Perrimon, N., Bartel, D. P., and Berger, B. (2011) Unusually effective microRNA targeting within repeat-rich coding regions of mammalian mRNAs, Genome Res., 21, 1395-1403, https://doi.org/10.1101/gr.121210.111.

43. Reczko, M., Maragkakis, M., Alexiou, P., Grosse, I., and Hatzigeorgiou, A. G. (2012) Functional microRNA targets in protein coding sequences, Bioinformatics, 28, 771-776, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts043.

44. Brümmer, A., and Hausser, J. (2014) MicroRNA binding sites in the coding region of mRNAs: extending the repertoire of post-transcriptional gene regulation, Bioessays, 36, 617-626, https://doi.org/10.1002/bies.201300104.