Координация нуклеозидтрифосфатов в активном центре терминальной дезоксирибонуклеотидилтрансферазы человека при матрица-независимом синтезе ДНК

Аннотация

Терминальная дезоксирибонуклеотидилтрансфераза человека (TdT) – ДНК-полимераза семейства X, отвечает за повышение разнообразия иммуноглобулинов и генов T‑клеточных рецепторов в процессе V(D)J‑рекомбинации путем матрица-независимого присоединения случайных нуклеотидов к 3′‑концу перестраиваемых сегментов V‑D и J‑D. Согласно рентгеноструктурным данным, координация входящего dNTP и 3′‑концевых нуклеотидов одноцепочечного праймера в активном центре TdT осуществляется за счет контактов с гидрофобными (W449, F404 и L397) и гидрофильными (R336, H342, D395, E456, R453 и R457) остатками, формирующими dNTP-связывающий карман. При этом остатки R336, H342 и D345 принимают непосредственное участие в ориентации фосфатных групп входящего dNTP и стабилизации 3′‑концевого нуклеотида ДНК-праймера. В настоящей работе был выполнен анализ последствий замены данных остатков методами молекулярной динамики и экспериментальной проверки ферментативных свойств мутантных форм TdT человека, содержащих замены R336Q, H342A и D345E. Полученные данные показали, что замена H342A вызывает увеличение константы диссоциации комплекса фермента с dNTP и ДНК-праймером и значительно уменьшает эффективность присоединения dNTP к растущей цепи. Замена D345E нарушает координацию ионов металла-кофактора и также оказывает влияние на эффективность каталитической реакции. Замена остатка R336 приводит к значительной дестабилизации структуры белковой глобулы и полной потере каталитической активности фермента. Полученные данные позволили установить молекулярные причины влияния замен R336Q, H342A и D345E на эффективность каталитического присоединения dNTP к ДНК-праймеру. Функциональное картирование активного центра нуклеотидилтрансфераз в перспективе может быть использовано для проведения рационального дизайна мутантных форм фермента, востребованных для реализации молекулярно-биологических и биотехнологических приложений.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Вклад авторов

Н.А. Кузнецов – концепция и руководство работой; С.И. Сенчурова – экспериментальные работы; Т.Е. Тюгашев – моделирование и анализ структурных данных; С.И. Сенчурова, Т.Е. Тюгашев, Н.А. Кузнецов – обсуждение результатов исследования; С.И. Сенчурова, Т.Е. Тюгашев, Н.А. Кузнецов – написание и редактирование текста статьи.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 21-64-00017-П) и частичной поддержке бюджетного финансирования № 125012300658-9, направленного на проведение вспомогательных работ и техническое обслуживание оборудования, использованного для выполнения исследования.

Благодарности

Работа выполнена с использованием ресурсов ИВЦ НГУ.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Raper, A. T., Reed, A. J., and Suo, Z. (2018) Kinetic mechanism of DNA polymerases: contributions of conformational dynamics and a third divalent metal ion, Chem. Rev., 118, 6000-6025, https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.7b00685.

2. Fowler, J. D., and Suo, Z. (2006) Biochemical, structural, and physiological characterization of terminal deoxynucleotidyl transferase, Chem. Rev., 106, 2092-2110, https://doi.org/10.1021/cr040445w.

3. Wu, W. J., Yang, W., and Tsai, M. D. (2017) How DNA polymerases catalyse replication and repair with contrasting fidelity, Nat. Rev. Chem., 1, 1-16, https://doi.org/10.1038/s41570-017-0068.

4. Bienstock, R. J., Beard, W. A., and Wilson, S. H. (2014) Phylogenetic analysis and evolutionary origins of DNA polymerase X-family members, DNA Repair (Amst), 22, 77-88, https://doi.org/10.1016/j.dnarep.2014.07.003.

5. Howard, M. J., Rodriguez, Y., and Wilson, S. H. (2017) DNA polymerase β uses its lyase domain in a processive search for DNA damage, Nucleic Acids Res., 45, 3822-3832, https://doi.org/10.1093/nar/gkx047.

6. Braithwaite, E. K., Kedar, P. S., Stumpo, D. J., Bertocci, B., Freedman, J. H., Samson, L. D., and Wilson, S. H. (2010) DNA polymerases β and λ mediate overlapping and independent roles in base excision repair in mouse embryonic fibroblasts, PLoS One, 5, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0012229.

7. Braithwaite, E. K., Kedar, P. S., Lan, L., Polosina, Y. Y., Asagoshi, K., Poltoratsky, V. P., Horton, J. K., Miller, H., Teebor, G. W., Yasui, A., and Wilson, S. H. (2005) DNA polymerase λ protects mouse fibroblasts against oxidative DNA damage and is recruited to sites of DNA damage/repair, J. Biol. Chem., 280, 31641-31647, https://doi.org/10.1074/jbc.C500256200.

8. García-Díaz, M., Domínguez, O., López-Fernández, L. A., De Lera, L. T., Saníger, M. L., Ruiz, J. F., Párraga, M., García-Ortiz, M. J., Kirchhoff, T., Del Mazo, J., Bernad, A., and Blanco, L. (2000) DNA polymerase lambda (Pol λ), a novel eukaryotic DNA polymerase with a potential role in meiosis, J. Mol. Biol., 301, 851-867, https://doi.org/10.1006/jmbi.2000.4005.

9. Alt, F. W., and Baltimore, D. (1982) Joining of immunoglobulin heavy chain gene segments: Implications from a chromosome with evidence of three D-J(H) fusions, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 4118-4122, https://doi.org/10.1073/pnas.79.13.4118.

10. Landau, N. R., Schatz, D. G., Rosa, M., and Baltimore, D. (1987) Increased frequency of N-region insertion in a murine pre-B-cell line infected with a terminal deoxynucleotidyl transferase retroviral expression vector, Mol. Cell. Biol., 7, 3237-3243, https://doi.org/10.1128/mcb.7.9.3237.

11. Motea, E. A., and Berdis, A. J. (2011) Tdt the story of a misguided DNA polymerase, Biochim. Biophys. Acta, 23, 1-7, https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2009.06.030.

12. Kato, K. I., Gonçalves, J. M., Houts, G. E., and Bollum, F. J. (1967) Deoxynucleotide-polymerizing enzymes of calf thymus gland. II. Properties of the terminal deoxynucleotidyltransferase, J. Biol. Chem., 242, 2780-2789, https://doi.org/10.1016/S0021-9258(18)99635-3.

13. Brack, C., Hirama, M., Lenhard-Schuller, R., and Tonegawa, S. (1978) A complete immunoglobulin gene is created by somatic recombination, Cell, 15, 1-14, https://doi.org/10.1016/0092-8674(78)90078-8.

14. Saito, H., Kranz, D. M., Takagaki, Y., Hayday, A. C., Eisen, H. N., and Tonegawa, S. (1984) A third rearranged and expressed gene in a clone of cytotoxic T lymphocytes, Nature, 312, 36-40, https://doi.org/10.1038/312036a0.

15. Sadofsky, M. (2001) The RAG proteins in V(D)J recombination: More than just a nuclease, Nucleic Acids Res., 29, 1399-1409, https://doi.org/10.1093/nar/29.7.1399.

16. Schatz, D. G., and Ji, Y. (2011) Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination, Nat. Rev. Immunol., 11, 251-263, https://doi.org/10.1038/nri2941.

17. Mahajan, K. N., Gangi-Peterson, L., Sorscher, D. H., Wang, J., Gathy, K. N., Mahajan, N. P., Reeves, W. H., and Mitchell, B. S. (1999) Association of terminal deoxynucleotidyl transferase with Ku, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 13926-13931, https://doi.org/10.1073/pnas.96.24.13926.

18. Mahajan, K. N., Nick McElhinny, S. A., Mitchell, B. S., and Ramsden, D. A. (2002) Association of DNA polymerase μ (pol μ) with Ku and ligase IV: role for pol μ in end-joining double-strand break repair, Mol. Cell. Biol., 22, 5194-5202, https://doi.org/10.1128/mcb.22.14.5194-5202.2002.

19. Loc’h, J., and Delarue, M. (2018) Terminal deoxynucleotidyltransferase: the story of an untemplated DNA polymerase capable of DNA bridging and templated synthesis across strands, Curr. Opin. Struct. Biol., 53, 22-31, https://doi.org/10.1016/j.sbi.2018.03.019.

20. Delarue, M., Boulé, J. B., Lescar, J., Expert-Bezançon, N., Jourdan, N., Sukumar, N., Rougeon, F., and Papanicolaou, C. (2002) Crystal structures of a template-independent DNA polymerase: murine terminal deoxynucleotidyltransferase, EMBO J., 21, 427-439, https://doi.org/10.1093/emboj/21.3.427.

21. Steitz, T. A., and Steitz, J. A. (1993) A general two-metal-ion mechanism for catalytic RNA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6498-6502, https://doi.org/10.1073/pnas.90.14.6498.

22. Kuznetsova, A. A., Tyugashev, T. E., Alekseeva, I. V., Timofeyeva, N. A., Fedorova, O. S., and Kuznetsov, N. A. (2022) Insight into the mechanism of DNA synthesis by human terminal deoxynucleotidyltransferase, Life Sci. Alliance, 5, 1-16, https://doi.org/10.26508/lsa.202201428.

23. Chang, L. M. S., and Bollum, F. J. (1990) Multiple roles of divalent cation in the terminal deoxynucleotidyltransferase reaction, J. Biol. Chem., 265, 17436-17440, https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)38181-x.

24. Mutt, E., and Sowdhamini, R. (2016) Molecular dynamics simulations and structural analysis to decipher functional impact of a twenty residue insert in the ternary complex of Mus musculus TdT isoform, PLoS One, 11, e0157286, https://doi.org/10.1371/JOURNAL.PONE.0157286.

25. Yang, B., Gathy, K. N., and Coleman, M. S. (1994) Mutational analysis of residues in the nucleotide binding domain of human terminal deoxynucleotidyl transferase, J. Biol. Chem., 269, 11859-11868, https://doi.org/10.1016/s0021-9258(17)32652-2.

26. Gouge, J., Rosario, S., Romain, F., Beguin, P., and Delarue, M. (2013) Structures of intermediates along the catalytic cycle of terminal deoxynucleotidyltransferase: Dynamical aspects of the two-metal ion mechanism, J. Mol. Biol., 425, 4334-4352, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2013.07.009.

27. Eisenstein, M. (2020) Single-cell RNA-seq analysis software providers scramble to offer solutions, Nat. Biotechnol., 38, 254-257, https://doi.org/10.1038/s41587-020-0449-8.

28. Hoose, A., Vellacott, R., Storch, M., Freemont, P. S., and Ryadnov, M. G. (2023) DNA synthesis technologies to close the gene writing gap, Nat. Rev. Chem., 7, 144-161, https://doi.org/10.1038/s41570-022-00456-9.

29. Jensen, M. A., and Davis, R. W. (2018) Template-independent enzymatic oligonucleotide synthesis (TiEOS): its history, prospects, and challenges, Biochemistry, 57, 1821-1832, https://doi.org/10.1021/acs.biochem.7b00937.

30. Verardo, D., Adelizzi, B., Rodriguez-Pinzon, D. A., Moghaddam, N., Thomée, E., Loman, T., Godron, X., and Horgan, A. (2023) Multiplex enzymatic synthesis of DNA with single-base resolution, Sci. Adv., 9, 1-12, https://doi.org/10.1126/sciadv.adi0263.

31. Kuznetsova, A. A., Senchurova, S. I., Gavrilova, A. A., Tyugashev, T. E., Mikushina, E. S., and Kuznetsov, N. A. (2024) Substrate specificity diversity of human terminal deoxynucleotidyltransferase may be a naturally programmed feature facilitating its biological function, Int. J. Mol. Sci., 25, https://doi.org/10.3390/ijms25020879.

32. Jamsen, J. A., Beard, W. A., Pedersen, L. C., Shock, D. D., Moon, A. F., Krahn, J. M., Bebenek, K., Kunkel, T. A., and Wilson, S. H. (2017) Time-lapse crystallography snapshots of a double-strand break repair polymerase in action, Nat. Commun., 8, 1-11, https://doi.org/10.1038/s41467-017-00271-7.

33. Šali, A. (2013) MODELLER: a program for protein structure modeling release 9.12, r9480, Rockefeller Univ., 779-815.

34. Abraham, M. J., Murtola, T., Schulz, R., Páll, S., Smith, J. C., Hess, B., and Lindah, E. (2015) GROMACS: High performance molecular simulations through multi-level parallelism from laptops to supercomputers, SoftwareX, 1-2, 19-25, https://doi.org/10.1016/J.SOFTX.2015.06.001.

35. Maier, J. A., Martinez, C., Kasavajhala, K., Wickstrom, L., Hauser, K. E., and Simmerling, C. (2015) ff14SB: improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB, J. Chem. Theory Comput., 11, 3696-3713, https://doi.org/10.1021/ACS.JCTC.5B00255.

36. Galindo-Murillo, R., Robertson, J. C., Zgarbová, M., Šponer, J., Otyepka, M., Jurečka, P., and Cheatham, T. E. (2016) Assessing the current state of amber force field modifications for DNA, J. Chem. Theory Comput., 12, 4114-4127, https://doi.org/10.1021/acs.jctc.6b00186.

37. Zgarbová, M., Šponer, J., and Jurečka, P. (2024) Refinement of the sugar puckering torsion potential in the AMBER DNA force field, bioRxiv, 2024.08.21.609021, https://doi.org/10.1021/acs.jctc.4c01100.

38. Jorgensen, W. L., Chandrasekhar, J., Madura, J. D., Impey, R. W., and Klein, M. L. (1983) Comparison of simple potential functions for simulating liquid water, J. Chem. Phys., 79, 926, https://doi.org/10.1063/1.445869.

39. Joung, I. S., and Cheatham, T. E. (2008) Determination of alkali and halide monovalent ion parameters for use in explicitly solvated biomolecular simulations, J. Phys. Chem. B, 112, 9020-9041, https://doi.org/10.1021/JP8001614.

40. Jiang, Y., Zhang, H., and Tan, T. (2016) Rational design of methodology-independent metal parameters using a nonbonded dummy model, J. Chem. Theory Comput., 12, 3250-3260, https://doi.org/10.1021/ACS.JCTC.6B00223.

41. Meagher, K. L., Redman, L. T., and Carlson, H. A. (2003) Development of polyphosphate parameters for use with the AMBER force field, J. Comput. Chem., 24, 1016-1025, https://doi.org/10.1002/JCC.10262.

42. Vanquelef, E., Simon, S., Marquant, G., Garcia, E., Klimerak, G., Delepine, J. C., Cieplak, P., and Dupradeau, F. Y. (2011) R.E.D. Server: a web service for deriving RESP and ESP charges and building force field libraries for new molecules and molecular fragments, Nucleic Acids Res., 39, https://doi.org/10.1093/NAR/GKR288.

43. Anandakrishnan, R., Aguilar, B., and Onufriev, A. V. (2012) H++ 3.0: Automating pK prediction and the preparation of biomolecular structures for atomistic molecular modeling and simulations, Nucleic Acids Res., 40, 537-541, https://doi.org/10.1093/nar/gks375.

44. Bussi, G., Donadio, D., and Parrinello, M. (2007) Canonical sampling through velocity rescaling, J. Chem. Phys., 126, 014101, https://doi.org/10.1063/1.2408420.

45. Parrinello, M., and Rahman, A. (1998) Polymorphic transitions in single crystals: a new molecular dynamics method, J. Appl. Phys., 52, 7182, https://doi.org/10.1063/1.328693.

46. Hess, B., Bekker, H., Berendsen, H. J. C., and Fraaije, J. G. E. M. (1997) LINCS: a linear constraint solver for molecular simulations, J. Comput Chem, 18, 14631472, https://doi.org/10.1002/(SICI)1096-987X(199709)18:12.

47. Essmann, U., Perera, L., Berkowitz, M. L., Darden, T., Lee, H., and Pedersen, L. G. (1995) A smooth particle mesh Ewald method, J. Chem. Phys., 103, 8577, https://doi.org/10.1063/1.470117.

48. McGibbon, R. T., Beauchamp, K. A., Harrigan, M. P., Klein, C., Swails, J. M., Hernández, C. X., Schwantes, C. R., Wang, L. P., Lane, T. J., and Pande, V. S. (2015) MDTraj: a modern open library for the analysis of molecular dynamics trajectories, Biophys. J., 109, 1528-1532, https://doi.org/10.1016/j.bpj.2015.08.015.

49. Bottaro, S., Bussi, G., Pinamonti, G., Reiber, S., Boomsma, W., and Lindorff-Larsen, K. (2019) Barnaba: software for analysis of nucleic acid structures and trajectories, RNA, 25, 219-231, https://doi.org/10.1261/rna.067678.118.

50. Jamsen, J. A., Sassa, A., Shock, D. D., Beard, W. A., and Wilson, S. H. (2021) Watching a double strand break repair polymerase insert a pro-mutagenic oxidized nucleotide, Nat. Commun., 12, 1-12, https://doi.org/10.1038/s41467-021-21354-6.

51. Freudenthal, B. D., Beard, W. A., Shock, D. D., and Wilson, S. H. (2013) Observing a DNA polymerase choose right from wrong, Cell, 154, 157-168, https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.05.048.

52. Zgarbová, M., Jurečka, P., Šponer, J., and Otyepka, M. (2018) A- to B-DNA transition in AMBER force fields and its coupling to sugar pucker, J. Chem. Theory Comput., 14, 319-328, https://doi.org/10.1021/acs.jctc.7b00926.

53. Strelnikov, I. A., Kovaleva, N. A., Klinov, A. P., and Zubova, E. A. (2023) C-B-A test of DNA force fields, ACS Omega, 8, 10253-10265, https://doi.org/10.1021/acsomega.2c07781.

54. Jurečka, P., Zgarbová, M., Černý, F., and Salomon, J. (2024) Multistate B- to A-transition in protein-DNA binding-how well is it described by current AMBER force fields? J. Biomol. Struct. Dyn., 43, 9017-9027 https://doi.org/10.1080/07391102.2024.2327539.

55. Ukladov, E. O., Tyugashev, T. E., and Kuznetsov, N. A. (2024) Computational modeling study of the molecular basis of dNTP selectivity in human terminal deoxynucleotidyltransferase, Biomolecules, 14, 1-16, https://doi.org/10.3390/biom14080961.

56. Moon, A. F., Pryor, J. M., Ramsden, D. A., Kunkel, T. A., Bebenek, K., and Pedersen, L. C. (2017) Structural accommodation of ribonucleotide incorporation by the DNA repair enzyme polymerase Mu, Nucleic Acids Res., 45, 9138-9148, https://doi.org/10.1093/nar/gkx527.

57. Jarchow-Choy, S. K., Krueger, A. T., Liu, H., Gao, J., and Kool, E. T. (2011) Fluorescent xDNA nucleotides as efficient substrates for a template-independent polymerase, Nucleic Acids Res., 39, 1586-1594, https://doi.org/10.1093/nar/gkq853.

58. Berdis, A. J., and McCutcheon, D. (2007) The use of non-natural nucleotides to probe template-independent DNA synthesis, ChemBioChem, 8, 1399-1408, https://doi.org/10.1002/CBIC.200700096.

59. Horáková, P., Macíčková-Cahová, H., Pivoňková, H., Spaček, J., Havran, L., Hocek, M., and Fojta, M. (2011) Tail-labelling of DNA probes using modified deoxynucleotide triphosphates and terminal deoxynucleotidyl transferase. Application in electrochemical DNA hybridization and protein-DNA binding assays, Org. Biomol. Chem., 9, 1366-1371, https://doi.org/10.1039/c0ob00856g.

60. Hollenstein, M. (2013) Deoxynucleoside triphosphates bearing histamine, carboxylic acid, and hydroxyl residues-synthesis and biochemical characterization, Org. Biomol. Chem., 11, 5162-5172, https://doi.org/10.1039/c3ob40842f.

61. Röthlisberger, P., Levi-Acobas, F., Sarac, I., Baron, B., England, P., Marlière, P., Herdewijn, P., and Hollenstein, M. (2017) Facile immobilization of DNA using an enzymatic his-tag mimic, Chem. Commun., 53, 13031-13034, https://doi.org/10.1039/C7CC07207D.

62. Lu, X., Li, J., Li, C., Lou, Q., Peng, K., Cai, B., Liu, Y., Yao, Y., Lu, L., and Tian, Z. (2022) Enzymatic DNA synthesis by engineering terminal deoxynucleotidyl transferase, ACS Catal., 12, 2988-2997, https://doi.org/10.1021/acscatal.1c04879.

63. Niu, Y., Chen, B., Zhang, H., Zheng, W., Wu, J., Yang, L., Yang, M., and Yu, H. (2025) Computational design of a thermostable and highly active terminal deoxynucleotidyl transferase for synthesis of long de novo DNA molecules, ACS Catal., 15, 7201-7216, https://doi.org/10.1021/acscatal.5c01571.

64. Date, T., Yamamoto, S., Tanihara, K., Nishimoto, Y., Liu, N., and Matsukage, A. (1990) Site-directed mutagenesis of recombinant rat DNA polymerase β: involvement of arginine-183 in primer recognition, Biochemistry, 29, 5027-5034, https://doi.org/10.1021/bi00473a005.

65. Kraynov, V. S. (1998) Structural basis for the catalytic efficiency, processivity substrate specificity and fidelity of DNA polymerase β, Ohio State Univ. Columbus, URL: https://rave.ohiolink.edu/etdc/view?acc_num=osu1487950153602297.

66. Kraynov, V. S., Showalter, A. K., Liu, J., Zhong, X., and Tsai, M. D. (2000) DNA polymerase beta: contributions of template-positioning and dNTP triphosphate-binding residues to catalysis and fidelity, Biochemistry, 39, 16008-16015, https://doi.org/10.1021/bi0008480.