Уникальный механизм глицин-специфического ингибирования бактериальной трансляции антибиотиком боттромицином А₂

Аннотация

Рост устойчивости патогенных бактерий к противомикробным препаратам является серьёзной проблемой для современной медицины, что подчёркивает острую потребность в новых терапевтических средствах. Боттромицин А₂ (BotA2) является перспективным кандидатом для будущей разработки лекарств, демонстрирующим активность в отношении клинически значимых патогенов, включая метициллин-резистентный Staphylococcus aureus, ванкомицин-резистентный Enterococcus и виды рода Mycoplasma. Однако молекулярный механизм действия BotA2 долгое время оставался неясным. В данной работе мы показываем, что BotA2 ингибирует бактериальную трансляцию, проявляя уникальную специфичность в отношении кодирующей последовательности мРНК. Используя метод тоупринтинга в сочетании с высокопроизводительным секвенированием (Toe‑seq анализ), мы обнаружили, что BotA2 вызывает остановку рибосомы преимущественно, когда глициновый кодон оказывается в A‑сайте рибосомы, и независимо от идентичности кодонов, располагающихся в P‑ и E‑сайтах. Наши биохимические и биофизические данные указывают на то, что BotA2 специфически блокирует тройные комплексы, доставляющие глицин, на рибосоме, тем самым предотвращая размещение Gly‑тРНК^Gly в пептидилтрансферазном центре рибосомы. В совокупности наши результаты раскрывают ранее не описанный механизм ингибирования трансляции, обусловленный иммобилизацией тройных комплексов на элонгирующих рибосомах в зависимости от последовательности мРНК.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Дополнительные материалы

Приложение 1

Приложение 2

Вклад авторов

И.А. Волынкина – валидация результатов, формальный анализ, обработка и хранение данных, программное обеспечение, постановка экспериментов (анализ трансляции in vitro, тоупринтинг, RelE-принтинг, анализ ошибок трансляции, синтез BODIPY-пептидов в системе PURExpress), написание текста статьи, подготовка иллюстраций, администрирование проекта; А.А. Грачев – формальный анализ, постановка экспериментов (синтез BODIPY-пептидов в реконструированной системе in vitro трансляции, измерение предстационарной кинетики, анализ коэлюции EF-Tu с рибосомами); А.Д. Ливенский – методология, валидация результатов, формальный анализ, обработка и хранение данных, постановка экспериментов (мечение клеточных метаболитов, GATRAL), написание текста статьи, подготовка иллюстраций; Д.К. Ягода – постановка экспериментов (анализ трансляции in vitro, тоупринтинг, RelE-принтинг, анализ чувствительности бактерий к антибиотикам, синтез BODIPY-пептидов в системе PURExpress, твердофазная экстракция); П.С. Касацкий – постановка экспериментов (выделение компонентов для реконструированной системы in vitro трансляции и постановка экспериментов с ней); О.А. Толичева – постановка экспериментов (синтез BODIPY-пептидов в реконструированной системе in vitro трансляции); Е.С. Комарова – методология, постановка экспериментов (анализ трансляции in vitro, Toe-seq), редактирование текста статьи, привлечение финансирования; А.Е. Тупикин – постановка экспериментов (высокопроизводительное секвенирование); В.А. Алферова – методология, валидация результатов, обработка и хранение данных, предоставление ресурсов, постановка экспериментов (выделение и очистка BotA2 и BotCA), написание текста статьи, подготовка иллюстраций; А.О. Каракчиева – постановка экспериментов (тоупринтинг, измерение МИК, твердофазная экстракция); А.А. Никандрова – обработка и хранение данных, постановка экспериментов (твердофазная экстракция, аналитическая ОФ-ВЭЖХ); М.В. Бирюков, Ю.В. Закалюкина и Л.В. Дорофеева – методология, постановка экспериментов (культивирование штамма-продуцента), редактирование текста статьи; Ю.А. Ихалайнен и И.А. Родин – валидация результатов, постановка экспериментов (ВЭЖХ-МСВР-анализ); Д.А. Лукьянов – методология, предоставление ресурсов, редактирование текста статьи, администрирование проекта; М.Р. Кабилов – формальный анализ, предоставление ресурсов, обработка и хранение данных, программное обеспечение; Е.В. Полесскова – методология, валидация результатов, формальный анализ, обработка и хранение данных, написание и редактирование текста статьи, подготовка иллюстраций, привлечение финансирования; А.Л. Коневега – концепция исследования, предоставление ресурсов, редактирование текста статьи, научное руководство, администрирование проекта; П.В. Сергиев – концепция исследования, формальный анализ, предоставление ресурсов, редактирование текста статьи, научное руководство, администрирование проекта; О.А. Донцова – предоставление ресурсов, научное руководство, привлечение финансирования; И.А. Волынкина, А.А. Грачев, А.Д. Ливенский, Е.С. Комарова, В.А. Алферова, Ю.А. Ихалайнен, Е.В. Полесскова, П.В. Сергиев – перевод текста статьи на русский язык.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, гранты: № 21-64-00006-P, рук. О.А. Донцова (бактериальная трансляция in vitro, тоупринтинг, RelE-принтинг, Toe-seq, эксперименты с бактериальными клетками), № 25-14-00253, рук. Е.В. Полесскова (эксперименты с реконструированной системой in vitro трансляции, предстационарная кинетика, коэлюция EF-Tu с рибосомами), и № 24-74-00057, рук. Е.С. Комарова (эукариотическая трансляция in vitro). Финансирующая организация не играла никакой роли в разработке концепции исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации и подготовке рукописи.

Благодарности

Мы выражаем нашу искреннюю благодарность профессору Рольфу Мюллеру и доктору Джой Биркельбах из Института фармацевтических исследований имени Гельмгольца в Сааре и Центра по исследованию инфекционных заболеваний имени Гельмгольца за предоставление стандартных образцов боттромицина А₂ и соответствующей карбоновой кислоты. Мы благодарим профессора Дэниела Н. Уилсона из Гамбургского университета за сотрудничество на ранних этапах развития проекта и ценные обсуждения. Мы особенно благодарны доктору Илье А. Остерману, который изначально задумал этот проект, за поддержку ранних этапов этой работы. Мы также выражаем признательность Юрию С. Поликанову и его коллегам из Иллинойсского университета, которые поделились с нами своими результатами экспериментов перед их публикацией. Мы также благодарим Андрея Г. Терещенкова и доктора Наталию В. Сумбатян из Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова за полезные предложения и попытки выявить сайт связывания боттромицина А₂. Мы благодарим Елизавету А. Разумову за помощь с репортёрными клетками E. coli ΔtolC pJC27. Мы благодарим доктора Дмитрия Е. Андреева из НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского за предоставление очищенного белка RelE и обсуждение результатов. Мы благодарим Тинаше П. Мавиза за предоставление штаммов E. coli SQ171, трансформированных плазмидами pLK35 и pAM552, несущими мутации устойчивости к антибиотикам. Мы благодарим сотрудников Центра коллективного пользования передовой масс-спектрометрии Сколтеха за проведение анализа методом LC-QTOF-MS, в особенности Марию Завьялову и Дмитрия Маслова. Получение препарата деацилированной суммарной тРНК, мечение клеточных метаболитов и общий анализ аминоацилирования тРНК были выполнены Алексеем Д. Ливенским, работа которого была поддержана Российским научным фондом (грант № 24-14-00181). ВЭЖХ-МСВР-анализ был проведён при поддержке Программы развития Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Дополнительная информация

Доступность данных. Данные высокопроизводительного секвенирования для Toe-seq анализа были депонированы в базу данных NCBI BioProject под регистрационным номером PRJNA1304769. Биоинформатические скрипты доступны по ссылке https://github.com/kabilov/Publication_scripts/tree/main/2024_Toe-seq. Другие данные, полученные и/или использованные в ходе работы, представлены в основном тексте статьи, дополнительных материалах или могут быть предоставлены по запросу, адресованному авторам для корреспонденции.

Список литературы

1. Waisvisz, J. M., van der Hoeven, M. G., van Peppen, J., and Zwennis, W. C. M. (1957) Bottromycin. I. A New sulfur-containing antibiotic, J. Am. Chem. Soc., 79, 4520-4521, https://doi.org/10.1021/ja01573a072.

2. Nakamura, S., Chikaike, T., Karasawa, K., Tanaka, N., Yonehara, H., and Umezawa, H. (1965) Isolation and characterization of bottromycins A and B, J. Antibiot., 18, 47-52.

3. Miller, B. M., Stapley, E. O., and Woodruff, H. B. (1967) Antimycoplasmal activity of the bottromycin complex and its production by Streptomyces canadensis, Antimicrob. Agents Chemother., 7, 407-414.

4. Tanaka, N., Nishimura, T., Nakamura, S., and Umezawa, H. (1968) Activity of bottromycin against Mycoplasma gallisepticum, J. Antibiotics, 21, 75-76, https://doi.org/10.7164/antibiotics.21.75.

5. Nakamura, S., Yajima, T., Lin, Y., and Umezawa, H. (1967) Isolation and characterization of bottromycins A2, B2, C2, J. Antibiotics, 20, 1-5.

6. Hou, Y., Tianero, M. D., Kwan, J. C., Wyche, T. P., Michel, C. R., Ellis, G. A., Vazquez-Rivera, E., Braun, D. R., Rose, W. E., Schmidt, E. W., and Bugni, T. S. (2012) Structure and biosynthesis of the antibiotic bottromycin D, Organic Lett., 14, 5050-5053, https://doi.org/10.1021/ol3022758.

7. Montalban-Lopez, M., Scott, T. A., Ramesh, S., Rahman, I. R., van Heel, A. J., Viel, J. H., Bandarian, V., Dittmann, E., Genilloud, O., Goto, Y., Grande Burgos, M. J., Hill, C., Kim, S., Koehnke, J., Latham, J. A., Link, A. J., Martinez, B., Nair, S. K., Nicolet, Y., Rebuffat, S., et al. (2021) New developments in RiPP discovery, enzymology and engineering, Nat. Product Rep., 38, 130-239, https://doi.org/10.1039/d0np00027b.

8. Sowa, S., Masumi, N., Inouye, Y., Nakamura, S., Takesue, Y., and Yokoyama, T. (1991) Susceptibility of methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical isolates to various antimicrobial agents, Hiroshima J. Med. Sci., 40, 137-144.

9. Shimamura, H., Gouda, H., Nagai, K., Hirose, T., Ichioka, M., Furuya, Y., Kobayashi, Y., Hirono, S., Sunazuka, T., and Omura, S. (2009) Structure determination and total synthesis of bottromycin A2: a potent antibiotic against MRSA and VRE, Angew. Chem. Int. Ed., 48, 914-917, https://doi.org/10.1002/anie.200804138.

10. Liao, Y. L. (1976) Studies on the new cell line TT-I: viral susceptibility and chromosomal changes related to mycoplasma contamination, Chin. J. Microbiol., 9, 37-44.

11. Ogata, M., Atobe, H., Kushida, H., and Yamamoto, K. (1971) In vitro sensitivity of mycoplasmas isolated from various animals and sewage to antibiotics and nitrofurans, J. Antibiotics, 24, 443-451, https://doi.org/10.7164/antibiotics.24.443.

12. Park, S. B., Lee, I. A., Suh, J. W., Kim, J. G., and Lee, C. H. (2011) Screening and identification of antimicrobial compounds from Streptomyces bottropensis suppressing rice bacterial blight, J. Microbiol. Biotechnol., 21, 1236-1242, https://doi.org/10.4014/jmb.1106.06047.

13. Franz, L., Kazmaier, U., Truman, A. W., and Koehnke, J. (2021) Bottromycins – biosynthesis, synthesis and activity, Nat. Product Rep., 38, 1659-1683, https://doi.org/10.1039/d0np00097c.

14. Kobayashi, Y., Ichioka, M., Hirose, T., Nagai, K., Matsumoto, A., Matsui, H., Hanaki, H., Masuma, R., Takahashi, Y., Omura, S., and Sunazuka, T. (2010) Bottromycin derivatives: efficient chemical modifications of the ester moiety and evaluation of anti-MRSA and anti-VRE activities, Bioorg. Med. Chem. Lett., 20, 6116-6120, https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2010.08.037.

15. Tanaka, N., Nishimura, T., Nakamura, S., and Umezawa, H. (1966) Biological studies on bottromycin A and its hydrazide, J. Antibiotics, 19, 149-154.

16. Miller, W. J., Chaiet, L., Rasmussen, G., Christensen, B., Hannah, J., Miller, A. K., and Wolf, F. J. (1968) Bottromycin. Separation of biologically active compounds and preparation and testing of amide derivatives, J. Med. Chem., 11, 746-749, https://doi.org/10.1021/jm00310a603.

17. Miller, W. J., Wolf, F. J., and Chaiet, L. (1968) A Methobottromycin and Process for Treating Poultry Infections. Individual, USA.

18. Wolf, F. J., and Miller, W. J. (1972) Amides of Methobottromycin. Merck and Co Inc., USA.

19. Frost, B. M., Valiant, M. E., and Dulaney, E. L. (1979) Synergism between efrotomycin and bottromycin, J. Antibiotics, 32, 1046-1049, https://doi.org/10.7164/antibiotics.32.1046.

20. Lerchen, H.-G., Schiffer, G., Brötz-Österhelt, H., Mayer-Bartschmid, A., Eckermann, S., Freiberg, C., Endermann, R., Schuhmacher, J., Meier, H., Svenstrup, N., Seip, S., Gehling, M., and Häbich, D. (2005) Cyclic Iminopeptide Derivatives. Aicuris Gmbh & Co. Kg, Germany.

21. Yamada, T., Yagita, M., Kobayashi, Y., Sennari, G., Shimamura, H., Matsui, H., Horimatsu, Y., Hanaki, H., Hirose, T., Satoshi, O. M., and Sunazuka, T. (2018) Synthesis and evaluation of antibacterial activity of bottromycins, J. Org. Chem., 83, 7135-7149, https://doi.org/10.1021/acs.joc.8b00045.

22. Bickel, E., and Kazmaier, U. (2024) Syntheses of bottromycin derivatives via Ugi-reactions and Matteson homologations, Org. Biomol. Chem., 22, 8811-8816, https://doi.org/10.1039/d4ob01373e.

23. Tanaka, N., Sashikata, K., Yamaguchi, H., and Umezawa, H. (1966) Inhibition of protein synthesis by bottromycin A2 and its hydrazide, J. Biochem., 60, 405-410, https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.jbchem.a128451.

24. Kinoshita, T., and Tanaka, N. (1970) On the site of action of bottromycin A2, J. Antibiotics, 23, 311-312, https://doi.org/10.7164/antibiotics.23.311.

25. Lin, Y. C., and Tanaka, N. (1968) Mechanism of action of bottromycin in polypeptide biosynthesis, J. Biochem., 63, 1-7, https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.jbchem.a128735.

26. Lin, Y. C., Kinoshita, T., and Tanaka, N. (1968) Mechanism of protein synthesis inhibition by bottromycin A2: studies with puromycin, J. Antibiotics, 21, 471-476, https://doi.org/10.7164/antibiotics.21.471.

27. Pestka, S., and Brot, N. (1971) Studies on the formation of transfer ribonucleic acid-ribosome complexes. XV. Effect of antibiotics on steps of bacterial protien synthesis: some new ribosomal inhibitors of translocation, J. Biol. Chem., 246, 7715-7722, https://doi.org/10.1016/s0021-9258(19)45834-1.

28. Otaka, T., and Kaji, A. (1981) Mode of action of bottromycin A2: effect on peptide bond formation, FEBS Lett., 123, 173-176, https://doi.org/10.1016/0014-5793(81)80280-3.

29. Tanaka, N., Lin, Y. C., and Okuyama, A. (1971) Studies on translocation of F-MET-tRNA and peptidyl-tRNA with antibiotics, Biochem. Biophys. Res. Commun., 44, 477-483, https://doi.org/10.1016/0006-291x(71)90626-7.

30. Otaka, T., and Kaji, A. (1976) Mode of action of bottromycin A2. Release of aminoacyl- or peptidyl-tRNA from ribosomes, J. Biol. Chem., 251, 2299-2306, https://doi.org/10.1016/S0021-9258(17)33586-X.

31. Otaka, T., and Kaji, A. (1983) Mode of action of bottromycin A2: effect of bottromycin A2 on polysomes, FEBS Lett., 153, 53-59, https://doi.org/10.1016/0014-5793(83)80118-5.

32. Pestka, S. (1970) Studies on the formation of transfer ribonucleic acid-ribosome complexes. IX. Effect of antibiotics on translocation and peptide bond formation, Arch. Biochem. Biophys., 136, 89-96, https://doi.org/10.1016/0003-9861(70)90330-9.

33. Cundliffe, E., and McQuillen, K. (1967) Bacterial protein synthesis: the effects of antibiotics, J. Mol. Biol., 30, 137-146, https://doi.org/10.1016/0022-2836(67)90249-5.

34. Pestka, S. (1972) Studies on transfer ribonucleic acid-ribosome complexes. XIX. Effect of antibiotics on peptidyl puromycin synthesis on polyribosoms from Escherichia coli, J. Biol. Chem., 247, 4669-4678, https://doi.org/10.1016/S0021-9258(19)45039-4.

35. Chernyshova, A. P., Marina, V. I., Tereshchenkov, A. G., Sagitova, V. E., Kryakvin, M. A., Dagaev, N. D., Yurchenko, E. G., Arzamazova, K. A., Guglya, E. B., Belozerova, O. A., Kovalchuk, S. I., Baranova, M. N., Kudzhaev, A. M., Shikov, A. E., Romanenko, M. N., Chebotar, V. K., Gancheva, M. S., Baganova, M. E., Biryukov, M. V., Panova, T. V., et al. (2025) Insights into the oxydifficidin’s mechanism of action, Preprints, 2025091868, https://doi.org/10.20944/preprints202509.1868.v1.

36. Volynkina, I. A., Zakalyukina, Y. V., Alferova, V. A., Belik, A. R., Yagoda, D. K., Nikandrova, A. A., Buyuklyan, Y. A., Udalov, A. V., Golovin, E. V., Kryakvin, M. A., Lukianov, D. A., Biryukov, M. V., Sergiev, P. V., Dontsova, O. A., and Osterman, I. A. (2022) Mechanism-based approach to new antibiotic producers screening among actinomycetes in the course of the citizen science project, Antibiotics, 11, 1198, https://doi.org/10.3390/antibiotics11091198.

37. Liu, J., Nothias, L. F., Dorrestein, P. C., Tahlan, K., and Bignell, D. R. D. (2021) Genomic and metabolomic analysis of the potato common scab pathogen Streptomyces scabiei, ACS Omega, 6, 11474-11487, https://doi.org/10.1021/acsomega.1c00526.

38. Shapovalova, K. S., Zatonsky, G. V., Razumova, E. A., Ipatova, D. A., Lukianov, D. A., Sergiev, P. V., Grammatikova, N. E., Tikhomirov, A. S., and Shchekotikhin, A. E. (2024) Synthesis and antibacterial activity of new 6″-modified tobramycin derivatives, Antibiotics, 13, 1191, https://doi.org/10.3390/antibiotics13121191.

39. Wiegand, I., Hilpert, K., and Hancock, R. E. (2008) Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances, Nat. Protocols, 3, 163-175, https://doi.org/10.1038/nprot.2007.521.

40. Paranjpe, M. N., Marina, V. I., Grachev, A. A., Maviza, T. P., Tolicheva, O. A., Paleskava, A., Osterman, I. A., Sergiev, P. V., Konevega, A. L., Polikanov, Y. S., and Gagnon, M. G. (2023) Insights into the molecular mechanism of translation inhibition by the ribosome-targeting antibiotic thermorubin, Nucleic Acids Res., 51, 449-462, https://doi.org/10.1093/nar/gkac1189.

41. Volynkina, I. A., Bychkova, E. N., Karakchieva, A. O., Tikhomirov, A. S., Zatonsky, G. V., Solovieva, S. E., Martynov, M. M., Grammatikova, N. E., Tereshchenkov, A. G., Paleskava, A., Konevega, A. L., Sergiev, P. V., Dontsova, O. A., Osterman, I. A., Shchekotikhin, A. E., and Tevyashova, A. N. (2024) Hybrid molecules of azithromycin with chloramphenicol and metronidazole: synthesis and study of antibacterial properties, Pharmaceuticals (Basel), 17, 187, https://doi.org/10.3390/ph17020187.

42. Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., and Shatsky, I. N. (2013) A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m⁷G-cap-, nor IRES-dependent, Nucleic Acids Res., 41, 1807-1816, https://doi.org/10.1093/nar/gks1282.

43. Akulich, K. A., Andreev, D. E., Terenin, I. M., Smirnova, V. V., Anisimova, A. S., Makeeva, D. S., Arkhipova, V. I., Stolboushkina, E. A., Garber, M. B., Prokofjeva, M. M., Spirin, P. V., Prassolov, V. S., Shatsky, I. N., and Dmitriev, S. E. (2016) Four translation initiation pathways employed by the leaderless mRNA in eukaryotes, Sci. Rep., 6, 37905, https://doi.org/10.1038/srep37905.

44. Prokhorova, I. V., Akulich, K. A., Makeeva, D. S., Osterman, I. A., Skvortsov, D. A., Sergiev, P. V., Dontsova, O. A., Yusupova, G., Yusupov, M. M., and Dmitriev, S. E. (2016) Amicoumacin A induces cancer cell death by targeting the eukaryotic ribosome, Sci. Rep., 6, 27720, https://doi.org/10.1038/srep27720.

45. Osterman, I. A., Prokhorova, I. V., Sysoev, V. O., Boykova, Y. V., Efremenkova, O. V., Svetlov, M. S., Kolb, V. A., Bogdanov, A. A., Sergiev, P. V., and Dontsova, O. A. (2012) Attenuation-based dual-fluorescent-protein reporter for screening translation inhibitors, Antimicrob. Agents Chemother., 56, 1774-1783, https://doi.org/10.1128/AAC.05395-11.

46. Orelle, C., Szal, T., Klepacki, D., Shaw, K. J., Vazquez-Laslop, N., and Mankin, A. S. (2013) Identifying the targets of aminoacyl-tRNA synthetase inhibitors by primer extension inhibition, Nucleic Acids Res., 41, e144, https://doi.org/10.1093/nar/gkt526.

47. Andreev, D., Hauryliuk, V., Terenin, I., Dmitriev, S., Ehrenberg, M., and Shatsky, I. (2008) The bacterial toxin RelE induces specific mRNA cleavage in the A site of the eukaryote ribosome, RNA, 14, 233-239, https://doi.org/10.1261/rna.693208.

48. Kabilov, M. R., Komarova, E. S., Pichkur, E. B., Zotova, P. A., Kasatsky, P. S., Volynkina, I. A., Tupikin, A. E., Pavlova, J. A., Lukianov, D. A., Osterman, I. A., Pyshniy, D. V., Paleskava, A., Bogdanov, A. A., Dontsova, O. A., Konevega, A. L., and Sergiev, P. V. (2024) Context specificity of translation inhibitors revealed by toe-seq, Res. Square, https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-3832009/v1.

49. Cashel, M. (1969) The control of ribonucleic acid synthesis in Escherichia coli. IV. Relevance of unusual phosphorylated compounds from amino acid-starved stringent strains, J. Biol. Chem., 244, 3133-3141, https://doi.org/10.1016/S0021-9258(18)93106-6.

50. Jain, I., Kolesnik, M., Kuznedelov, K., Minakhin, L., Morozova, N., Shiriaeva, A., Kirillov, A., Medvedeva, S., Livenskyi, A., Kazieva, L., Makarova, K. S., Koonin, E. V., Borukhov, S., Severinov, K., and Semenova, E. (2024) tRNA anticodon cleavage by target-activated CRISPR-Cas13a effector, Sci. Adv., 10, eadl0164, https://doi.org/10.1126/sciadv.adl0164.

51. Paleskava, A., Maksimova, E. M., Vinogradova, D. S., Kasatsky, P. S., Kirillov, S. V., and Konevega, A. L. (2021) Differential contribution of protein factors and 70S ribosome to elongation, Int. J. Mol. Sci., 22, 9614, https://doi.org/10.3390/ijms22179614.

52. Tolicheva, O. A., Bidzhieva, M. S., Kasatskiy, P. S., Marina, V. I., Sergiev, P. V., Konevega, A. L., and Paleskava, A. (2024) Separation of short fluorescently labeled peptides by gel electrophoresis for an in vitro translation study, Nanobiotechnol. Rep., 19, 423-431, https://doi.org/10.1134/S263516762460127X.

53. Takada, H., Crowe-McAuliffe, C., Polte, C., Sidorova, Z. Y., Murina, V., Atkinson, G. C., Konevega, A. L., Ignatova, Z., Wilson, D. N., and Hauryliuk, V. (2021) RqcH and RqcP catalyze processive poly-alanine synthesis in a reconstituted ribosome-associated quality control system, Nucleic Acids Res., 49, 8355-8369, https://doi.org/10.1093/nar/gkab589.

54. Milon, P., Konevega, A. L., Peske, F., Fabbretti, A., Gualerzi, C. O., and Rodnina, M. V. (2007) Transient kinetics, fluorescence, and FRET in studies of initiation of translation in bacteria, Methods Enzymol., 430, 1-30, https://doi.org/10.1016/S0076-6879(07)30001-3.

55. Marina, V. I., Bidzhieva, M., Tereshchenkov, A. G., Orekhov, D., Sagitova, V. E., Sumbatyan, N. V., Tashlitsky, V. N., Ferberg, A. S., Maviza, T. P., Kasatsky, P., Tolicheva, O., Paleskava, A., Polshakov, V. I., Osterman, I. A., Dontsova, O. A., Konevega, A. L., and Sergiev, P. V. (2024) An easy tool to monitor the elemental steps of in vitro translation via gel electrophoresis of fluorescently labeled small peptides, RNA, 30, 298-307, https://doi.org/10.1261/rna.079766.123.

56. Osterman, I. A., Wieland, M., Maviza, T. P., Lashkevich, K. A., Lukianov, D. A., Komarova, E. S., Zakalyukina, Y. V., Buschauer, R., Shiriaev, D. I., Leyn, S. A., Zlamal, J. E., Biryukov, M. V., Skvortsov, D. A., Tashlitsky, V. N., Polshakov, V. I., Cheng, J., Polikanov, Y. S., Bogdanov, A. A., Osterman, A. L., Dmitriev, S. E., et al. (2020) Tetracenomycin X inhibits translation by binding within the ribosomal exit tunnel, Nat. Chem. Biol., 16, 1071-1077, https://doi.org/10.1038/s41589-020-0578-x.

57. Batool, Z., Pavlova, J. A., Paranjpe, M. N., Tereshchenkov, A. G., Lukianov, D. A., Osterman, I. A., Bogdanov, A. A., Sumbatyan, N. V., and Polikanov, Y. S. (2024) Berberine analog of chloramphenicol exhibits a distinct mode of action and unveils ribosome plasticity, Structure, 32, 1429-1442.e1426, https://doi.org/10.1016/j.str.2024.06.013.

58. Pichkur, E. B., Paleskava, A., Tereshchenkov, A. G., Kasatsky, P., Komarova, E. S., Shiriaev, D. I., Bogdanov, A. A., Dontsova, O. A., Osterman, I. A., Sergiev, P. V., Polikanov, Y. S., Myasnikov, A. G., and Konevega, A. L. (2020) Insights into the improved macrolide inhibitory activity from the high-resolution cryo-EM structure of dirithromycin bound to the E. coli 70S ribosome, RNA, 26, 715-723, https://doi.org/10.1261/rna.073817.119.

59. Grossman, T. H., Starosta, A. L., Fyfe, C., O’Brien, W., Rothstein, D. M., Mikolajka, A., Wilson, D. N., and Sutcliffe, J. A. (2012) Target- and resistance-based mechanistic studies with TP-434, a novel fluorocycline antibiotic, Antimicrob. Agents Chemotherapy, 56, 2559-2564, https://doi.org/10.1128/AAC.06187-11.

60. Osterman, I. A., Khabibullina, N. F., Komarova, E. S., Kasatsky, P., Kartsev, V. G., Bogdanov, A. A., Dontsova, O. A., Konevega, A. L., Sergiev, P. V., and Polikanov, Y. S. (2017) Madumycin II inhibits peptide bond formation by forcing the peptidyl transferase center into an inactive state, Nucleic Acids Res., 45, 7507-7514, https://doi.org/10.1093/nar/gkx413.

61. Weisblum, B., and Demohn, V. (1969) Erythromycin-inducible resistance in Staphylococcus aureus: survey of antibiotic classes involved, J. Bacteriol., 98, 447-452, https://doi.org/10.1128/jb.98.2.447-452.1969.

62. Long, K. S., Poehlsgaard, J., Kehrenberg, C., Schwarz, S., and Vester, B. (2006) The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to phenicols, lincosamides, oxazolidinones, pleuromutilins, and streptogramin A antibiotics, Antimicrob. Agents Chemotherapy, 50, 2500-2505, https://doi.org/10.1128/AAC.00131-06.

63. Pavlova, J. A., Khairullina, Z. Z., Tereshchenkov, A. G., Nazarov, P. A., Lukianov, D. A., Volynkina, I. A., Skvortsov, D. A., Makarov, G. I., Abad, E., Murayama, S. Y., Kajiwara, S., Paleskava, A., Konevega, A. L., Antonenko, Y. N., Lyakhovich, A., Osterman, I. A., Bogdanov, A. A., and Sumbatyan, N. V. (2021) Triphenilphosphonium analogs of chloramphenicol as dual-acting antimicrobial and antiproliferating agents, Antibiotics, 10, 489, https://doi.org/10.3390/antibiotics10050489.

64. Wilson, D. N. (2009) The A-Z of bacterial translation inhibitors, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 44, 393-433, https://doi.org/10.3109/10409230903307311.

65. Orelle, C., Carlson, S., Kaushal, B., Almutairi, M. M., Liu, H., Ochabowicz, A., Quan, S., Pham, V. C., Squires, C. L., Murphy, B. T., and Mankin, A. S. (2013) Tools for characterizing bacterial protein synthesis inhibitors, Antimicrob. Agents Chemother., 57, 5994-6004, https://doi.org/10.1128/AAC.01673-13.

66. O’Shea, J. P., Chou, M. F., Quader, S. A., Ryan, J. K., Church, G. M., and Schwartz, D. (2013) pLogo: a probabilistic approach to visualizing sequence motifs, Nat. Methods, 10, 1211-1212, https://doi.org/10.1038/nmeth.2646.

67. Gonzalez de Valdivia, E. I., and Isaksson, L. A. (2004) A codon window in mRNA downstream of the initiation codon where NGG codons give strongly reduced gene expression in Escherichia coli, Nucleic Acids Res., 32, 5198-5205, https://doi.org/10.1093/nar/gkh857.

68. Osterman, I. A., Chervontseva, Z. S., Evfratov, S. A., Sorokina, A. V., Rodin, V. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Zatsepin, T. S., Kabilov, M. R., Bogdanov, A. A., Gelfand, M. S., Dontsova, O. A., and Sergiev, P. V. (2020) Translation at first sight: the influence of leading codons, Nucleic Acids Res., 48, 6931-6942, https://doi.org/10.1093/nar/gkaa430.

69. Johansson, M., Ieong, K. W., Trobro, S., Strazewski, P., Aqvist, J., Pavlov, M. Y., and Ehrenberg, M. (2011) pH-sensitivity of the ribosomal peptidyl transfer reaction dependent on the identity of the A-site aminoacyl-tRNA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108, 79-84, https://doi.org/10.1073/pnas.1012612107.

70. Vang Nielsen, S., Turnbull, K. J., Roghanian, M., Baerentsen, R., Semanjski, M., Brodersen, D. E., Macek, B., and Gerdes, K. (2019) Serine-threonine kinases encoded by Split hipA homologs inhibit tryptophanyl-tRNA synthetase, mBio, 10, e01138-01119, https://doi.org/10.1128/mBio.01138-19.

71. Piskunova, J., Maisonneuve, E., Germain, E., Gerdes, K., and Severinov, K. (2017) Peptide-nucleotide antibiotic Microcin C is a potent inducer of stringent response and persistence in both sensitive and producing cells, Mol. Microbiol., 104, 463-471, https://doi.org/10.1111/mmi.13640.

72. Kudrin, P., Varik, V., Oliveira, S. R., Beljantseva, J., Del Peso Santos, T., Dzhygyr, I., Rejman, D., Cava, F., Tenson, T., and Hauryliuk, V. (2017) Subinhibitory concentrations of bacteriostatic antibiotics induce relA-dependent and rela-independent tolerance to beta-lactams, Antimicrob. Agents Chemotherapy, 61, e02173-02116, https://doi.org/10.1128/AAC.02173-16.

73. Ovchinnikov, S. V., Bikmetov, D., Livenskyi, A., Serebryakova, M., Wilcox, B., Mangano, K., Shiriaev, D. I., Osterman, I. A., Sergiev, P. V., Borukhov, S., Vazquez-Laslop, N., Mankin, A. S., Severinov, K., and Dubiley, S. (2020) Mechanism of translation inhibition by type II GNAT toxin AtaT2, Nucleic Acids Res., 48, 8617-8625, https://doi.org/10.1093/nar/gkaa551.

74. Haseltine, W. A., and Block, R. (1973) Synthesis of guanosine tetra- and pentaphosphate requires the presence of a codon-specific, uncharged transfer ribonucleic acid in the acceptor site of ribosomes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 1564-1568, https://doi.org/10.1073/pnas.70.5.1564.

75. Sinha, A. K., and Winther, K. S. (2021) The RelA hydrolase domain acts as a molecular switch for (p)ppGpp synthesis, Commun. Biol., 4, 434, https://doi.org/10.1038/s42003-021-01963-z.

76. Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., and Gerdes, K. (2015) Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology, Nat. Rev. Microbiol., 13, 298-309, https://doi.org/10.1038/nrmicro3448.

77. Dabrowska, G., Prusinska, J., and Goc, A. (2006) The stringent response – bacterial mechanism of an adaptive stress response [in Russian], Postepy Biochem., 52, 87-93.

78. Potrykus, K., and Cashel, M. (2008) (p)ppGpp: still magical? Annu. Rev. Microbiol., 62, 35-51, https://doi.org/10.1146/annurev.micro.62.081307.162903.

79. Urwin, L., Savva, O., and Corrigan, R. M. (2024) Microbial primer: what is the stringent response and how does it allow bacteria to survive stress? Microbiology, 170, 001483, https://doi.org/10.1099/mic.0.001483.

80. Metlitskaya, A., Kazakov, T., Kommer, A., Pavlova, O., Praetorius-Ibba, M., Ibba, M., Krasheninnikov, I., Kolb, V., Khmel, I., and Severinov, K. (2006) Aspartyl-tRNA synthetase is the target of peptide nucleotide antibiotic Microcin C, J. Biol. Chem., 281, 18033-18042, https://doi.org/10.1074/jbc.M513174200.

81. Hughes, J., and Mellows, G. (1978) Inhibition of isoleucyl-transfer ribonucleic acid synthetase in Escherichia coli by pseudomonic acid, Biochem. J., 176, 305-318, https://doi.org/10.1042/bj1760305.

82. Bikmetov, D., Hall, A. M. J., Livenskyi, A., Gollan, B., Ovchinnikov, S., Gilep, K., Kim, J. Y., Larrouy-Maumus, G., Zgoda, V., Borukhov, S., Severinov, K., Helaine, S., and Dubiley, S. (2022) GNAT toxins evolve toward narrow tRNA target specificities, Nucleic Acids Res., 50, 5807-5817, https://doi.org/10.1093/nar/gkac356.

83. Giuliodori, A. M., Spurio, R., Milon, P., and Fabbretti, A. (2018) Antibiotics targeting the 30S ribosomal subunit: a lesson from nature to find and develop new drugs, Curr. Top. Med. Chem., 18, 2080-2096, https://doi.org/10.2174/1568026618666181025092546.

84. Manickam, N., Joshi, K., Bhatt, M. J., and Farabaugh, P. J. (2016) Effects of tRNA modification on translational accuracy depend on intrinsic codon-anticodon strength, Nucleic Acids Res., 44, 1871-1881, https://doi.org/10.1093/nar/gkv1506.

85. Campbell, E. A., Korzheva, N., Mustaev, A., Murakami, K., Nair, S., Goldfarb, A., and Darst, S. A. (2001) Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase, Cell, 104, 901-912, https://doi.org/10.1016/s0092-8674(01)00286-0.

86. Pedersen, K., Zavialov, A. V., Pavlov, M. Y., Elf, J., Gerdes, K., and Ehrenberg, M. (2003) The bacterial toxin RelE displays codon-specific cleavage of mRNAs in the ribosomal A site, Cell, 112, 131-140, https://doi.org/10.1016/s0092-8674(02)01248-5.

87. Rodnina, M. V. (2018) Translation in prokaryotes, Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 10, a032664, https://doi.org/10.1101/cshperspect.a032664.

88. Walter, J. D., Hunter, M., Cobb, M., Traeger, G., and Spiegel, P. C. (2012) Thiostrepton inhibits stable 70S ribosome binding and ribosome-dependent GTPase activation of elongation factor G and elongation factor 4, Nucleic Acids Res., 40, 360-370, https://doi.org/10.1093/nar/gkr623.

89. Bailly, C. (2022) The bacterial thiopeptide thiostrepton. An update of its mode of action, pharmacological properties and applications, Eur. J. Pharmacol., 914, 174661, https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2021.174661.

90. Cvetesic, N., and Gruic-Sovulj, I. (2017) Synthetic and editing reactions of aminoacyl-tRNA synthetases using cognate and non-cognate amino acid substrates, Methods, 113, 13-26, https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2016.09.015.

91. Pape, T., Wintermeyer, W., and Rodnina, M. V. (1998) Complete kinetic mechanism of elongation factor Tu-dependent binding of aminoacyl-tRNA to the A site of the E. coli ribosome, EMBO J., 17, 7490-7497, https://doi.org/10.1093/emboj/17.24.7490.

92. Scarano, G., Krab, I. M., Bocchini, V., and Parmeggiani, A. (1995) Relevance of histidine-84 in the elongation factor Tu GTPase activity and in poly(Phe) synthesis: its substitution by glutamine and alanine, FEBS Lett., 365, 214-218, https://doi.org/10.1016/0014-5793(95)00469-p.

93. Rodnina, M. V., Fricke, R., Kuhn, L., and Wintermeyer, W. (1995) Codon-dependent conformational change of elongation factor Tu preceding GTP hydrolysis on the ribosome, EMBO J., 14, 2613-2619, https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1995.tb07259.x.

94. Parmeggiani, A., and Swart, G. W. (1985) Mechanism of action of kirromycin-like antibiotics, Annu. Rev. Microbiol., 39, 557-577, https://doi.org/10.1146/annurev.mi.39.100185.003013.

95. Prezioso, S. M., Brown, N. E., and Goldberg, J. B. (2017) Elfamycins: inhibitors of elongation factor-Tu, Mol. Microbiol., 106, 22-34, https://doi.org/10.1111/mmi.13750.

96. Parmeggiani, A., Krab, I. M., Watanabe, T., Nielsen, R. C., Dahlberg, C., Nyborg, J., and Nissen, P. (2006) Enacyloxin IIa pinpoints a binding pocket of elongation factor Tu for development of novel antibiotics, J. Biol. Chem., 281, 2893-2900, https://doi.org/10.1074/jbc.m505951200.

97. Li, L. H., Timmins, L. G., Wallace, T. L., Krueger, W. C., Prairie, M. D., and Im, W. B. (1984) Mechanism of action of didemnin B, a depsipeptide from the sea, Cancer Lett., 23, 279-288, https://doi.org/10.1016/0304-3835(84)90095-8.

98. Carelli, J. D., Sethofer, S. G., Smith, G. A., Miller, H. R., Simard, J. L., Merrick, W. C., Jain, R. K., Ross, N. T., and Taunton, J. (2015) Ternatin and improved synthetic variants kill cancer cells by targeting the elongation factor-1A ternary complex, Elife, 4, e10222, https://doi.org/10.7554/elife.10222.

99. Schmeing, T. M., Voorhees, R. M., Kelley, A. C., Gao, Y. G., Murphy, F. V. 4th, Weir, J. R., and Ramakrishnan, V. (2009) The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA, Science, 326, 688-694, https://doi.org/10.1126/science.1179700.

100. Fischer, N., Neumann, P., Konevega, A. L., Bock, L. V., Ficner, R., Rodnina, M. V., and Stark, H. (2015) Structure of the E. coli ribosome-EF-Tu complex at <3 Å resolution by Cs-corrected cryo-EM, Nature, 520, 567-570, https://doi.org/10.1038/nature14275.

101. Shao, S., Murray, J., Brown, A., Taunton, J., Ramakrishnan, V., and Hegde, R. S. (2016) Decoding mammalian ribosome-mRNA states by translational GTPase complexes, Cell, 167, 1229-1240.e1215, https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.10.046.

102. Juette, M. F., Carelli, J. D., Rundlet, E. J., Brown, A., Shao, S., Ferguson, A., Wasserman, M. R., Holm, M., Taunton, J., and Blanchard, S. C. (2022) Didemnin B and ternatin-4 differentially inhibit conformational changes in eEF1A required for aminoacyl-tRNA accommodation into mammalian ribosomes, Elife, 11, e81608, https://doi.org/10.7554/elife.81608.

103. Travin, D. Y., Basu, R. S., Paranjpe, M. N., Klepacki, D., Zhurakovskaya, A. I., Vázquez-Laslop, N., Mankin, A. S., Polikanov, Y. S., and Gagnon, M. G. (2025) Sequence-specific trapping of EF-Tu/glycyl-tRNA complex on the ribosome by bottromycin, bioRxiv, https://doi.org/10.1101/2025.08.17.670399.

104. Zaytsev, K., Bogatyreva, N., and Fedorov, A. (2024) Link between individual codon frequencies and protein expression: going beyond codon adaptation index, Int. J. Mol. Sci., 25, 11622, https://doi.org/10.3390/ijms252111622.

105. Dong, H., Nilsson, L., and Kurland, C. G. (1996) Co-variation of tRNA abundance and codon usage in Escherichia coli at different growth rates, J. Mol. Biol., 260, 649-663, https://doi.org/10.1006/jmbi.1996.0428.

106. Rodnina, M. V. (2016) The ribosome in action: tuning of translational efficiency and protein folding, Protein Sci., 25, 1390-1406, https://doi.org/10.1002/pro.2950.

107. Kurata, S., Weixlbaumer, A., Ohtsuki, T., Shimazaki, T., Wada, T., Kirino, Y., Takai, K., Watanabe, K., Ramakrishnan, V., and Suzuki, T. (2008) Modified uridines with C5-methylene substituents at the first position of the tRNA anticodon stabilize U•G wobble pairing during decoding, J. Biol. Chem., 283, 18801-18811, https://doi.org/10.1074/jbc.M800233200.

108. Choi, J., Marks, J., Zhang, J., Chen, D. H., Wang, J., Vazquez-Laslop, N., Mankin, A. S., and Puglisi, J. D. (2020) Dynamics of the context-specific translation arrest by chloramphenicol and linezolid, Nat. Chem. Biol., 16, 310-317, https://doi.org/10.1038/s41589-019-0423-2.

109. Vior, N. M., Cea-Torrescassana, E., Eyles, T. H., Chandra, G., and Truman, A. W. (2020) Regulation of bottromycin biosynthesis involves an internal transcriptional start site and a cluster-situated modulator, Front. Microbiol., 11, 495, https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.00495.

110. Sikandar, A., Franz, L., Adam, S., Santos-Aberturas, J., Horbal, L., Luzhetskyy, A., Truman, A. W., Kalinina, O. V., and Koehnke, J. (2020) The bottromycin epimerase BotH defines a group of atypical alpha/beta-hydrolase-fold enzymes, Nat. Chem. Biol., 16, 1013-1018, https://doi.org/10.1038/s41589-020-0569-y.