17β‑Гидроксистероиддегидрогеназа из гриба Cochliobolus lunatus: биосинтез в клетках актинобактерий Mycolicibacterium neoaurum и функциональная характеристика

Аннотация

17β‑Гидроксистероиддегидрогеназа (17β‑ГСД) – фермент, используемый в биотехнологии получения тестостерона из фитостерина. Гетерологичная 17β‑ГСД из гриба Cochliobolus lunatus катализирует NADPH-зависимое восстановление 17‑оксогруппы андростендиона/андростадиендиона, образующихся в клетках миколицибактерий в результате присущего им полиферментного процесса окисления алифатической боковой цепи фитостерина, с образованием тестостерона/Δ¹‑дегидротестостерона соответственно. Объектом исследования являлась гетерологичная 17β‑ГСД из гриба C. lunatus (17β‑ГСД_Cl) с 6×His‑меткой (6×His‑17β‑ГСД_Cl), синтезированная в клетках актинобактерий Mycolicibacterium neoaurum. Выделение и очистку рекомбинантного фермента проводили с помощью аффинной хроматографии. Наибольшую активность ферментный препарат 6×His‑17β‑ГСД_Cl проявлял по отношению к андростендиону. Активность 6×His‑17β‑ГСД_Cl зависела от NADPH и проявлялась в интервале рН от 6,0 до 9,0 с оптимумом при рН 7,0. Анализ кинетических характеристик показал, что свойства гетерологичного фермента 6×His‑17β‑ГСД_Cl, синтезированного в клетках M. neoaurum, сравнимы c таковыми, полученными для фермента 17β‑ГСД, выделенного из гриба C. lunatus, а также для рекомбинантных ферментов 17β‑ГСД_Cl, синтезированных в клетках Escherichia coli и Mycolicibacterium smegmatis. Результаты расширяют знания о микробных 17β‑ГСД и свидетельствуют о перспективности применения рекомбинантных штаммов M. neoaurum, экспрессирующих кодон-оптимизированную последовательность кДНК, кодирующую 17β‑ГСД_Cl из гриба C. lunatus, для получения тестостерона из фитостерина.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Вклад авторов

Т.А. Тимакова, В.В. Фокина, М.В. Карпов, В.М. Николаева – концепция и проведение экспериментов; Д.Н. Текучева – проведение экспериментов; А.А. Шутов – ВЭЖХ-анализ; Т.А. Тимакова, В.В. Фокина, В.М. Николаева, М.В. Карпов, Д.Н. Текучева – обсуждение результатов исследования и написание текста; М.В. Донова – руководство работой и редактирование текста статьи.

Финансирование

Работа выполнена Тимаковой Т.А., Шутовым А.А., Николаевой В.М., Доновой М.В. в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации № 122040500054-3 по теме «Генетический контроль, ферментные системы и рекомбинантные технологии для получения продуцентов ценных изопреноидов»; Фокиной В.В., Текучевой Д.Н. и Карповым М.В. – в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации № 125041005029-5 по теме FMRM-2025-0032 «Разработка геном-ориентированных технологий и методов метаболической инженерии для создания высокопроизводительных бактериальных продуцентов и поливидовых консорциумов для биотехнологии, агропромышленного комплекса и пищевой промышленности».

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Tekucheva, D. N., Nikolayeva, V. M., Karpov, M. V., Timakova, T. A., Shutov, A. A., and Donova, M. V. (2022) Bioproduction of testosterone from phytosterol by Mycolicibacterium neoaurum strains: “one-pot”, two modes, Bioresour. Bioprocess, 9, 116, https://doi.org/10.1186/s40643-022-00602-7.

2. Tekucheva, D. N., Fokina, V. V., Nikolayeva, V. M, Shutov, A. A., Karpov, M. V., and Donova, M. V. (2022) Cascade biotransformation of phytosterol to testosterone by Mycolicibacterium neoaurum VKM Ac-1815D and Nocardioides simplex VKM Ac-2033D strains, Microbiology, 91, 303-312, https://doi.org/10.1134/S0026261722300099.

3. Fernandez-Cabezon, L., Galan, B., and Garcıa, J. L. (2016) Engineering Mycobacterium smegmatis for testosterone production, Microb. Biotechnol., 10, 151-161, https://doi.org/10.1111/1751-7915.12433.

4. Cassetta, A., Budefeld, T., Rizner, T. L., Kristan, K., Stojan, J., and Lamba, D. (2005) Crystallization, X-ray diffraction analysis and phasing of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase from the fungus Cochliobolus lunatus, Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun., 61, 1032-1034, https://doi.org/10.1107/S1744309105034949.

5. Brunskole, M., Kristan, K., Stojan, J., and Rizner, T. L. (2009) Mutations that affect coenzyme binding and dimer formation of fungal 17β-hydroxysteroid dehydrogenase, Mol. Cell. Endocrinol., 301, 47-50, https://doi.org/10.1016/j.mce.2008.07.023.

6. Fürtges, L., Conradt, D., Schätzle, M. A., Singh, S. K., Krasevec, N., Rizner, T. L., Müller, M., and Husain, S. M. (2016) Phylogenetic studies, gene cluster analysis, and enzymatic reaction support anthrahydroquinone reduction as the physiological function of fungal 17β-hydroxysteroid dehydrogenase, Chem. Biochem., 18, 77-80, https://doi.org/10.1002/cbic.201600489.

7. Zorko, M., Gottlieb, H. E., and Zakelj-Mavric, M. (2000) Pluripotency of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase from the filamentous fungus Cochliobolus lunatus, Steroids, 65, 46-53, https://doi.org/10.1016/s0039-128x(99)00085-9.

8. Rizner, T.L., Stojan, J., and Adamski, J. (2001) Searching for the physiological function of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase from the fungus Cochliobolus lunatus: studies of substrate specificity and expression analysis, Mol. Cell. Endocrinol., 171, 193-198, https://doi.org/10.1016/s0303-7207(00)00424-x.

9. Plemenitas, A., Zakelj-Mavric, M., and Komel, R. (1998) Hydroxysteroid dehydrogenase of Cochliobolus lunatus, J. Steroid. Biochem., 29, 371-372, https://doi.org/10.1016/0022-4731(88)90041-6.

10. Kristan, K., Rizner, T. L., Stojan, J., Gerber, J. K., Kremmer, E., and Adamski, J. (2003) Significance of individual amino acid residues for coenzyme and substrate specificity of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase from the fungus Cochliobolus lunatus, Chem. Biol. Interact., 143-144, 493-501, https://doi.org/10.1016/s0009-2797(02)00205-3.

11. Kristan, K., Deluca, D., Adamski, J., Stojan, J., and Rizner, T. L. (2005) Dimerization and enzymatic activity of fungal 17β-hydroxysteroid dehydrogenase from the short-chain dehydrogenase/reductase superfamily, BMC Biochem., 6, 28, https://doi.org/10.1186/1471-2091-6-28.

12. Ulrih, N. P., and Rizner, T., L. (2006) Conformational stability of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase from the fungus Cochliobolus lunatus, FEBS J., 273, 3927-3937, https://doi.org/10.1111/j.1742.

13. Kristan, K., Adamski, J., Rizner, T. L, and Stojan J. (2007) His164 regulates accessibility to the active site in fungal 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase, Biochimie, 89, 63-71, https://doi.org/10.1016/j.biochi.2006.09.004.

14. Zhou, Y., Wang, Y., Chen, X., Feng, J., Wang, M., Wu, Q., and Zhu, D. (2021) Modulating the active site lid of an alcohol dehydrogenase from Ralstonia sp. enabled efficient stereospecific synthesis of 17β-hydroxysteroids, Enzyme Microb. Technol., 149, 109837, https://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2021.109837.

15. Wei, Y., Mei, G., Zhao, J., Zhang, S., Qin, W., Sheng, Q., and Yang, Z. (2023) Testosterone biosynthesis from 4-androstene-3,17-dione catalyzed via bifunctional ketoreductase, Fermentation, 9, 998, https://doi.org/10.3390/fermentation9120998.

16. Guevara, G., Olortegui Flores, Y., Fernandez de Las Heras, L., Perera, J., and Navarro Llorens, J. M. (2019) Metabolic engineering of Rhodococcus ruber Chol-4: A cell factory for testosterone production, PLoS One, 14, e0220492, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220492.

17. Tekucheva, D. N., Karpov, M. V., Fokina, V. V., Timakova, T. A., Shutov, A. A., and Donova, M. V. (2024) Single-stage bioconversion of phytosterol into testosterone by recombinant strains of Mycolicibacterium neoaurum, Microbiology, 93, 134-138, https://doi.org/10.1134/S0026261723603913.

18. Karpov, M., Sukhodolskaya, G., Nikolaeva, V., Fokina, V., Shutov, A., Donova, M., and Strizhov, N. (2016) Bio-based testosterone production from phytosterol, Proc. Nat. Acad. Sci. Belarus Chem. Ser., 3, 78.

19. Strizhov, N., Karpov, M., Sukhodolskaya, G., Nikolayeva, V., Fokina, V., Shutov, A., and Donova, M. (2016) Development of mycobacterial strains producing testosterone Proc. Nat. Acad. Sci. Belarus, Chem. Ser., 3, 57-58.

20. Berne, S., Lah, L., Korosec, B., Krasevec, N., and Komel, R. (2008) Progesterone-induced gene expression profile of the filamentous fungus Cochliobolus lunatus, Acta Chim. Slov., 55, 93-100.

21. Timakova, T. A., Fokina, V. V., Bubnova, T. V., Nemashkalov, V. A., and Donova, M. V. (2022) Optimization of growth conditions for the testosterone-producing Mycolicibacterium neoaurum strain, Opera Med. Physiol., 9, 98-104, https://doi.org/10.24412/2500-2295-2022-3-98-104.

22. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685, https://doi.org/10.1038/227680a0.

23. Jork, H., Funk, W., Fischer, W., and Wimmer, H. (1990) Thin-layer chromatography. Reagents and detection methods. Physical and chemical detection methods: fundamentals, reagents I, VCH: Weinheim, Germany, 1a, 333-336.

24. Lobastova, T., Fokina, V., Pozdnyakova-Filatova, I., Tarlachkov, S., Shutov, A., and Donova, M. (2022) Insight into different stages of steroid degradation in thermophilic Saccharopolyspora hirsuta VKM Ac-666^T strain, Int. J. Mol. Sci., 23, 16174. https://doi.org/10.3390/ijms232416174.

25. Rizner, T. L., and Zakelj-Mavric, M. (2000) Characterization of fungal 17β-hydroxysteroid dehydrogenases, Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol., 127, 53-63, https://doi.org/10.1016/s0305-0491(00)00234-0.

26. Тимакова Т. А., Карпов М. В., Текучева Д. Н., Николаева В. М., Шутов А. А. (2024) Получение рекомбинантной НАДФН-зависимой 17β-гидроксистероиддегидрогеназы и характеристика ее активности in vitro. Сборник докладов Международной научной конференции Актуальные аспекты и перспективы развития современной биотехнологии, Белгород, с. 110-116.

27. Bragin, E. Y., Shtratnikova, V. Y., Dovbnya, D. V., Schelkunov, M. I., Pekov, Y. A., Malakho, S. G., Egorova, O. V., Ivashina, T. V., Sokolov, S. L., Ashapkin, V. V., and Donova, M. V. (2013) Comparative analysis of genes encoding key steroid core oxidation enzymes in fast-growing Mycobacterium spp. strains, J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 138, 41-53, https://doi.org/10.1016/j.jsbmb.2013.02.016.

28. Rohman, A., and Dijkstra, B. W. (2021) Application of microbial 3-ketosteroid Δ¹-dehydrogenases in biotechnology, Biotechnol. Adv., 49, 107751, https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2021.107751.

29. Egorova, O. V., Nikolayeva, V. M., Suzina, N. E., and Donova, M. V. (2004) Localization of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase in Mycobacterium sp. VKM Ac-1815D mutant strain, J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 94, 519-525, https://doi.org/10.1016/j.jsbmb.2004.12.044.

30. Rizner, T. L., Zakelj-Mavric, M., Plemenitas, A., and Zorko, M. (1996) Purification and characterization of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase from the filamentous fungus Cochliobolus lunatus, J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 59, 205-214, https://doi.org/10.1016/s0960-0760(96)00098-2.

31. Rizner, T. L., Moeller, G., Thole, H. H., Zakelj-Mavric, M., and Adamski, J. (1999) A novel 17β-hydroxysteroid dehydrogenase in the fungus Cochliobolus lunatus: new insights into the evolution of steroid-hormone signalling, Biochem. J., 337, 425-431, https://doi.org/10.1042/0264-6021:3370425.