БИОХИМИЯ, 2024, том 89, вып. 12, с. 2132–2144

УДК 577.12

Влияние производных 8‑оксо‑1,N6‑этеноаденина на работу РНК‑полимераз вируса SARS‑CoV‑2 и бактерии Escherichia coli

© 2024 И.В. Петушков 1,2*#telomer1@rambler.ru, А.В. Аралов 3,4#, И.А. Иванов 3,5, М.С. Баранов 3,6, Т.С. Зацепин 7, А.В. Кульбачинский 1,2*avkulb@yandex.ru

1 Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», 123182 Москва, Россия

2 Институт биологии гена РАН, 119334 Москва, Россия

3 ФГБУН ГНЦ РФ «Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской академии наук, 117997 Москва, Россия

4 Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы, 117198 Москва, Россия

5 Общество с ограниченной ответственностью «Органикум», 127486 Москва, Россия

6 Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова, 117997 Москва, Россия

7 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991 Москва, Россия

Поступила в редакцию 26.10.2024
После доработки 29.11.2024
Принята к публикации 01.12.2024

DOI: 10.31857/S0320972524120099

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: модифицированные нуклеиновые основания, РНК‑полимераза, транскрипция, ингибиторы транскрипции, SARS‑CoV‑2.

Статья на английском языке опубликована в режиме Open Access (открытого доступа) на сайте издательства Springer. DOI: 10.1134/S0006297924120149.

Аннотация

Бактериальные и вирусные РНК‑полимеразы являются перспективными мишенями для разработки новых ингибиторов транскрипции. Одним из потенциальных блокаторов синтеза РНК является 7,8‑дигидро‑8‑оксо‑1,N6-этеноаденин (oxo‑εA) – синтетическое соединение, которое представляет собой комбинацию двух модификаций аденина: 8‑оксоаденина (oxo‑A) и 1,N6‑этеноаденина (εA). В данном исследовании мы синтезировали oxo‑εA-трифосфат (oxo‑εATP) и показали, что он может включаться РНК-зависимой РНК-полимеразой вируса SARS‑CoV‑2 в состав синтезируемой РНК напротив матричных остатков A и G в присутствии ионов Mn2+. В случае РНК-полимеразы Escherichia coli включение происходит напротив остатков A в матричной цепи ДНК. В случае нахождения oxo‑εA вместо аденина в матричной цепи ДНК происходит полная остановка транскрипции в месте модификации. В то же время oxo‑εAТР не подавляет синтез РНК обеими РНК-полимеразами в присутствии немодифицированных нуклеотидов, то есть не может эффективно конкурировать с природными субстратами. Таким образом, oxo‑εA-модификация значительно нарушает матричные свойства нуклеотида при синтезе РНК РНК-полимеразами разных классов, и соответствующие производные нуклеотидов не являются потенциальными противовирусными или антибактериальными ингибиторами транскрипции.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

* Авторы внесли равный вклад в работу.

Дополнительные материалы

Приложение

Вклад авторов

А.В. Аралов, А.В. Кульбачинский, И.В. Петушков – концепция работы; А.В. Аралов, И.А. Иванов, М.С. Баранов и Т.С. Зацепин – химический синтез и очистка oxo-εATP и модифицированных ДНК-олигонуклеотидов; И.В. Петушков – проведение экспериментов; А.В. Аралов, А.В. Кульбачинский, И.В. Петушков – обсуждение результатов и написание статьи.

Финансирование

Работа проведена в рамках выполнения государственного задания НИЦ «Курчатовский институт».

Благодарности

Авторы благодарят А. Макарову, Е. Шилкина, Е. Болдинову (ИБГ РАН) за ценную дискуссию.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Aralov, A. V., Gubina, N., Cabrero, C., Tsvetkov, V. B., Turaev, A. V., Fedeles, B. I., Croy, R. G., Isaakova, E. A., Melnik, D., Dukova, S., Ryazantsev, D. Y., Khrulev, A. A., Varizhuk, A. M., Gonzalez, C., Zatsepin, T. S., and Essigmann, J. M. (2022) 7,8-Dihydro-8-oxo-1,N6-ethenoadenine: an exclusively Hoogsteen-paired thymine mimic in DNA that induces A–>T transversions in Escherichia coli, Nucleic Acids Res., 50, 3056-3069, https://doi.org/10.1093/nar/gkac148.

2. Kim, D., Lee, J.-Y., Yang, J.-S., Kim, J. W., Kim, V. N., and Chang, H. (2020) The architecture of SARS-CoV-2 transcriptome, Cell, 181, 914-921.e910, https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.04.011.

3. Hillen, H. S., Kokic, G., Farnung, L., Dienemann, C., Tegunov, D., and Cramer, P. (2020) Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase, Nature, 584, 154-156, https://doi.org/10.1038/s41586-020-2368-8.

4. Shannon, A., Selisko, B., Le, N. T., Huchting, J., Touret, F., Piorkowski, G., Fattorini, V., Ferron, F., Decroly, E., Meier, C., Coutard, B., Peersen, O., and Canard, B. (2020) Rapid incorporation of Favipiravir by the fast and permissive viral RNA polymerase complex results in SARS-CoV-2 lethal mutagenesis, Nat. Commun., 11, 4682, https://doi.org/10.1038/s41467-020-18463-z.

5. Yin, X., Popa, H., Stapon, A., Bouda, E., and Garcia-Diaz, M. (2023) Fidelity of ribonucleotide incorporation by the SARS-CoV-2 replication complex, J. Mol. Biol., 435, 167973, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2023.167973.

6. Moeller, N. H., Shi, K., Demir, O., Belica, C., Banerjee, S., Yin, L., Durfee, C., Amaro, R. E., and Aihara, H. (2022) Structure and dynamics of SARS-CoV-2 proofreading exoribonuclease ExoN, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 119, https://doi.org/10.1073/pnas.2106379119.

7. Drake, J. W., and Holland, J. J. (1999) Mutation rates among RNA viruses, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 13910-13913, https://doi.org/10.1073/pnas.96.24.13910.

8. Jenkins, G. M., Rambaut, A., Pybus, O. G., and Holmes, E. C. (2002) Rates of molecular evolution in RNA viruses: a quantitative phylogenetic analysis, J. Mol. Evol., 54, 156-165, https://doi.org/10.1007/s00239-001-0064-3.

9. Sanjuan, R., Nebot, M. R., Chirico, N., Mansky, L. M., and Belshaw, R. (2010) Viral mutation rates, J. Virol., 84, 9733-9748, https://doi.org/10.1128/JVI.00694-10.

10. Jones, A. N., Mourao, A., Czarna, A., Matsuda, A., Fino, R., Pyrc, K., Sattler, M., and Popowicz, G. M. (2022) Characterization of SARS-CoV-2 replication complex elongation and proofreading activity, Sci. Rep., 12, 9593, https://doi.org/10.1038/s41598-022-13380-1.

11. Petushkov, I., Esyunina, D., and Kulbachinskiy, A. (2023) Effects of natural RNA modifications on the activity of SARS-CoV-2 RNA-dependent RNA polymerase, FEBS J., 290, 80-92, https://doi.org/10.1111/febs.16587.

12. Sacramento, C. Q., Fintelman-Rodrigues, N., Temerozo, J. R., da Silva, A. P. D., Dias, S., da Silva, C. D. S., Ferreira, A. C., Mattos, M., Pao, C. R. R., de Freitas, C. S., Soares, V. C., Hoelz, L. V. B., Fernandes, T. V. A., Branco, F. S. C., Bastos, M. M., Boechat, N., Saraiva, F. B., Ferreira, M. A., Jockusch, S., Wang, X., Tao, C., Chien, M., Xie, W., Patel, D., et al. (2021) In vitro antiviral activity of the anti-HCV drugs daclatasvir and sofosbuvir against SARS-CoV-2, the aetiological agent of COVID-19, J. Antimicrob. Chemother., 76, 1874-1885, https://doi.org/10.1093/jac/dkab072.

13. Jockusch, S., Tao, C., Li, X., Chien, M., Kumar, S., Morozova, I., Kalachikov, S., Russo, J. J., and Ju, J. (2020) Sofosbuvir terminated RNA is more resistant to SARS-CoV-2 proofreader than RNA terminated by Remdesivir, Sci. Rep., 10, 16577, https://doi.org/10.1038/s41598-020-73641-9.

14. Kokic, G., Hillen, H. S., Tegunov, D., Dienemann, C., Seitz, F., Schmitzova, J., Farnung, L., Siewert, A., Hobartner, C., and Cramer, P. (2021) Mechanism of SARS-CoV-2 polymerase stalling by remdesivir, Nat. Commun., 12, 279, https://doi.org/10.1038/s41467-020-20542-0.

15. Yin, W. M. C., Luan, X., Shen, D. D., Shen, Q., Su, H., Wang, X., Zhou, F., Zhao, W., Gao, M., Chang, S., Xie, Y. C., Tian, G., Jiang, H. W., Tao, S. C., Shen, J., Jiang, Y., Jiang, H., Xu, Y., Zhang, S., Zhang, Y., and Xu, H. E. (2020) Structural basis for inhibition of the RNA-dependent RNA polymerase from SARS-CoV-2 by remdesivir, Science, 368, 1499-1504, https://doi.org/10.1126/science.abc1560.

16. Kabinger, F. S. C., Schmitzová, J., Dienemann, C., Kokic, G., Hillen, H. S., Höbartner, C., and Cramer, P. (2021) Mechanism of molnupiravir-induced SARS-CoV-2 mutagenesis, Nat. Struct. Mol. Biol., 28, 740-746, https://doi.org/10.1038/s41594-021-00651-0.

17. Wang, J., Shi, Y., Reiss, K., Maschietto, F., Lolis, E., Konigsberg, W. H., Lisi, G. P., and Batista, V. S. (2022) Structural insights into binding of remdesivir triphosphate within the replication–transcription complex of SARS-CoV-2, Biochemistry, 61, 1966-1973, https://doi.org/10.1021/acs.biochem.2c00341.

18. Gordon, C. J., Tchesnokov, E. P., Woolner, E., Perry, J. K., Feng, J. Y., Porter, D. P., and Götte, M. (2020) Remdesivir is a direct-acting antiviral that inhibits RNA-dependent RNA polymerase from severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 with high potency, J. Biol. Chem., 295, 6785-6797, https://doi.org/10.1074/jbc.RA120.013679.

19. Gordon, C. J., Tchesnokov, E. P., Schinazi, R. F., and Götte, M. (2021) Molnupiravir promotes SARS-CoV-2 mutagenesis via the RNA template, J. Biol. Chem., 297, 100770, https://doi.org/10.1016/j.jbc.2021.100770.

20. Tchesnokov, E. P., Gordon, C. J., Woolner, E., Kocinkova, D., Perry, J. K., Feng, J. Y., Porter, D. P., and Götte, M. (2020) Template-dependent inhibition of coronavirus RNA-dependent RNA polymerase by remdesivir reveals a second mechanism of action, J. Biol. Chem., 295, 16156-16165, https://doi.org/10.1074/jbc.AC120.015720.

21. Luo, X., Wang, X., Yao, Y., Gao, X., and Zhang, L. (2022) Unveiling the “template-dependent” inhibition on the viral transcription of SARS-CoV-2, J. Phys. Chem. Lett., 13, 7197-7205, https://doi.org/10.1021/acs.jpclett.2c01314.

22. Apostle, A., Yin, Y., Chillar, K., Eriyagama, A., Arneson, R., Burke, E., Fang, S., and Yuan, Y. (2023) Effects of epitranscriptomic RNA modifications on the catalytic activity of the SARS-CoV-2 replication complex, Chembiochem, 24, https://doi.org/10.1002/cbic.202300095.

23. Iyer, L. M., and Aravind, L. (2012) Insights from the architecture of the bacterial transcription apparatus, J. Struct. Biol., 179, 299-319, https://doi.org/10.1016/j.jsb.2011.12.013.

24. Steitz, T. A. (1998) A mechanism for all polymerases, Nature, 391, 231-232, https://doi.org/10.1038/34542.

25. Sosunov, V., Sosunova, E., Mustaev, A., Bass, I., Nikiforov, V., and Goldfarb, A. (2003) Unified two-metal mechanism of RNA synthesis and degradation by RNA polymerase, EMBO J., 22, 2234-2244, https://doi.org/10.1093/emboj/cdg193.

26. James, K., Gamba, P., Cockell, S. J., and Zenkin, N. (2017) Misincorporation by RNA polymerase is a major source of transcription pausing in vivo, Nucleic Acids Res., 45, 1105-1113, https://doi.org/10.1093/nar/gkw969.

27. Imashimizu, M., Oshima, T., Lubkowska, L., and Kashlev, M. (2013) Direct assessment of transcription fidelity by high-resolution RNA sequencing, Nucleic Acids Res., 41, 9090-9104, https://doi.org/10.1093/nar/gkt698.

28. Mäkinen, J., Shin, Y., Vieras, E., Virta, P., Metsä-Ketelä, M., Murakami, K., and Belogurov, G. (2021) The mechanism of the nucleo-sugar selection by multi-subunit RNA polymerases, Nat. Commun., 12, https://doi.org/10.1038/s41467-021-21005-w.

29. Nedialkov, Y. A., and Burton, Z. F. (2013) Translocation and fidelity of Escherichia coli RNA polymerase, Transcription, 4, 136-143, https://doi.org/10.4161/trns.25527.

30. Nudler, E., Gusarov, I., and Bar-Nahum, G. (2003) Methods of Walking with the RNA Polymerase, in Methods in Enzymology, Academic Press, pp. 160-169.

31. Agapov, A., Olina, A., and Kulbachinskiy, A. (2022) RNA polymerase pausing, stalling and bypass during transcription of damaged DNA: from molecular basis to functional consequences, Nucleic Acids Res., 50, 3018-3041, https://doi.org/10.1093/nar/gkac174.

32. Gehring, A. M., and Santangelo, T. J. (2017) Archaeal RNA polymerase arrests transcription at DNA lesions, Transcription, 8, 288-296, https://doi.org/10.1080/21541264.2017.1324941.

33. Pupov, D., Ignatov, A., Agapov, A., and Kulbachinskiy, A. (2019) Distinct effects of DNA lesions on RNA synthesis by Escherichia coli RNA polymerase, Biochem. Biophys. Res. Commun., 510, 122-127, https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2019.01.062.

34. Guseva, E. A., Kamzeeva, P. N., Sokolskaya, S. Y., Slushko, G. K., Belyaev, E. S., Myasnikov, B. P., Golubeva, J. A., Alferova, V. A., Sergiev, P. V., and Aralov, A. V. (2024) Modified (2′-deoxy)adenosines activate autophagy primarily through AMPK/ULK1-dependent pathway, Bioorg. Med. Chem. Lett., 113, 129980, https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2024.129980.

35. Svetlov, V., and Artsimovitch, I. (2015) Purification of bacterial RNA polymerase: tools and protocols, Methods Mol. Biol., 1276, 13-29, https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2392-2_2.

36. Kore, A. R., Shanmugasundaram, M., Senthilvelan, A., and Srinivasan, B. (2012) Gram-scale chemical synthesis of 2′-deoxynucleoside-5′-O-triphosphates, Curr. Protocols Nucleic Acid Chem., 49, 13.10.11-13.10.12, https://doi.org/10.1002/0471142700.nc1310s49.

37. Kamzeeva, P., Petushkov, I., Knizhnik, E., Snoeck, R., Khodarovich, Y., Ryabukhina, E., Alferova, V., Eshtukov-Shcheglov, A., Belyaev, E., Svetlova, J., Vedekhina, T., Kulbachinskiy, A., Varizhuk, A., Andrei, G., and Aralov, A. (2023) Phenotypic test of benzo[4,5]imidazo[1,2-c]pyrimidinone-based nucleoside and non-nucleoside derivatives against DNA and RNA viruses, including coronaviruses, Int. J. Mol. Sci., 24, 14540, https://doi.org/10.3390/ijms241914540.

38. Miropolskaya, N., Kozlov, M., Petushkov, I., Prostova, M., Pupov, D., Esyunina, D., Kochetkov, S., and Kulbachinskiy, A. (2023) Effects of natural polymorphisms in SARS-CoV-2 RNA-dependent RNA polymerase on its activity and sensitivity to inhibitors in vitro, Biochimie, 206, 81-88, https://doi.org/10.1016/j.biochi.2022.10.007.

39. Matyugina, E., Petushkov, I., Surzhikov, S., Kezin, V., Maslova, A., Ivanova, O., Smirnova, O., Kirillov, I., Fedyakina, I., Kulbachinskiy, A., Kochetkov, S., and Khandazhinskaya, A. (2023) Nucleoside analogs that inhibit SARS-CoV-2 replication by blocking interaction of virus polymerase with RNA, Int. J. Mol. Sci., 24, 3361, https://doi.org/10.3390/ijms24043361.

40. Zhilina, E., Miropolskaya, N., Bass, I., Brodolin, K., and Kulbachinskiy, A. (2011) Characteristics of sigma-dependent pausing in RNA polymerases from E. coli and T. aquaticus, Biochemistry (Moscow), 76, 1348-1358, https://doi.org/10.1134/S0006297911100038.

41. Zhilina, E., Esyunina, D., Brodolin, K., and Kulbachinskiy, A. (2012) Structural transitions in the transcription elongation complexes of bacterial RNA polymerase during sigma-dependent pausing, Nucleic Acids Res., 40, 3078-3091, https://doi.org/10.1093/nar/gkr1158.

42. Petushkov, I., Esyunina, D., and Kulbachinskiy, A. (2017) σ38-dependent promoter-proximal pausing by bacterial RNA polymerase, Nucleic Acids Res., 45, 3006-3016, https://doi.org/10.1093/nar/gkw1213.

43. Leonard, G. A., Guy, A., Brown, T., Teoule, R., and Hunter, W. N. (1992) Conformation of guanine-8-oxoadenine base pairs in the crystal structure of d(CGCGAATT(O8A)GCG), Biochemistry, 31, 8415-8420, https://doi.org/10.1021/bi00151a004.

44. Arnold, J. J., and Cameron, C. E. (2004) Poliovirus RNA-dependent RNA polymerase (3Dpol): pre-steady-state kinetic analysis of ribonucleotide incorporation in the presence of Mg2+, Biochemistry, 43, 5126-5137, https://doi.org/10.1021/bi035212y.

45. Arnold, J. J., Gohara, D. W., and Cameron, C. E. (2004) Poliovirus RNA-dependent RNA polymerase (3Dpol): pre-steady-state kinetic analysis of ribonucleotide incorporation in the presence of Mg2+, Biochemistry, 43, 5138-5148, https://doi.org/10.1021/bi035213q.

46. Huang, Y., Beaudry, A., McSwiggen, J., and Sousa, R. (1997) Determinants of ribose specificity in RNA polymerization: effects of Mn2+ and deoxynucleoside monophosphate incorporation into transcripts, Biochemistry, 36, 13718-13728, https://doi.org/10.1021/bi971609o.

47. Ranjith-Kumar, C. T., Kim, Y. C., Gutshall, L., Silverman, C., Khandekar, S., Sarisky, R. T., and Kao, C. C. (2002) Mechanism of de novo initiation by the hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase: role of divalent metals, J. Virol., 76, 12513-12525, https://doi.org/10.1128/jvi.76.24.12513-12525.2002.

48. Te Velthuis, A. J. W., Arnold, J. J., Cameron, C. E., van den Worm, S. H. E., and Snijder, E. J. (2009) The RNA polymerase activity of SARS-coronavirus nsp12 is primer dependent, Nucleic Acids Res., 38, 203-214, https://doi.org/10.1093/nar/gkp904.

49. Gottesman, M. E., Chudaev, M., and Mustaev, A. (2020) Key features of magnesium that underpin its role as the major ion for electrophilic biocatalysis, FEBS J., 287, 5439-5463, https://doi.org/10.1111/febs.15318.

50. Poranen, M. M., Salgado, P. S., Koivunen, M. R. L., Wright, S., Bamford, D. H., Stuart, D. I., and Grimes, J. M. (2008) Structural explanation for the role of Mn2+ in the activity of ϕ6 RNA-dependent RNA polymerase, Nucleic Acids Res., 36, 6633-6644, https://doi.org/10.1093/nar/gkn632.

51. Vassylyev, D. G., Vassylyeva, M. N., Zhang, J., Palangat, M., Artsimovitch, I., and Landick, R. (2007) Structural basis for substrate loading in bacterial RNA polymerase, Nature, 448, 163-168, https://doi.org/10.1038/nature05931.