Постселекционное конструирование аптамеров: сравнительное исследование аффинности ДНК-аптамеров к рекомбинантному внеклеточному домену рецептора эпидермального фактора роста человека

Аннотация

В работе дана сравнительная оценка аффинности сконструированных ДНК‑аптамеров к внеклеточному домену рецептора эпидермального фактора роста человека (EGFR*). Суммированы данные по аффинности 20 аптамеров, опубликованные ранее. Разнообразие способов селекции аптамеров и методов измерения аффинности требует унификации алгоритмов сравнения. Это необходимо и для следующего важного этапа – конструирования аптамеров для постселекционной подгонки к белку-мишени EGFR*. В данной работе сравнили аффинность ДНК‑аптамеров из двух семейств, U31 и U2, полученных ранее Wu et al. из одной селекции [Wu et al. (2014) PLoS One, 9, e90752], и их производных аптамерных конструкций GR20, U2s и Gol1, полученных нами рациональным дизайном. Аффинность к EGFR* измеряли двумя разными методами: равновесным в растворе – поляризацией флуоресценции FAM‑меченых аптамеров, и кинетическим на поверхности – интерферометрией биослоёв с иммобилизованными аптамерами. В отличие от значений равновесных констант, полученных титрованием аптамера белком и выраженных в единицах концентрации последнего, более информативным оказался анализ профилей самого титрования, а также кинетики взаимодействия, которые позволили определить влияние на аффинность даже субтильных изменений в аптамерах и их конструкциях. Сформулированы гипотезы о соотношениях «структура–функция» и механизмах узнавания. Данные, полученные для набора аптамерных конструкций, критичны для перехода к изучению взаимодействия аптамеров с мишенями рецептора эпидермального фактора роста в составе клеток.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Дополнительные материалы

Приложение

Вклад авторов

Копылов А.М., Павлова Г.В. – концепция и руководство работой; Антипова О.А., Моисеенко В.Л., Рыбина А.А. – проведение экспериментов; Антипова О.А., Рыбина А.А., Моисеенко В.Л., Копылов А.М., Мухаметова Л.И., Ерёмин С.А. – обсуждение результатов исследования; Моисеенко В.Л., Антипова О.М., Копылов А.М. – написание и редактирование текста статьи.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Министерства науки и высшего образования РФ (соглашение № 075-15-2024-561 от 24.04.2024 г.).

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания выполненных авторами исследований с участием людей или использованием животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Di Mauro, V., Lauta, F.C., Modica, J., Appleton, S. L., De Franciscis, V., and Catalucci, D. (2023) Diagnostic and therapeutic aptamers: a promising pathway to improved cardiovascular disease management, JACC Basic Transl. Sci., 9, 260-277, https://doi.org/10.1016/j.jacbts.2023.06.013.

2. Kejamurthy, P., and Devi, K. T. R. (2023) Immune checkpoint inhibitors and cancer immunotherapy by aptamers: an overview, Med. Oncol., 41, 40, https://doi.org/10.1007/s12032-023-02267-4.

3. Lin, B., Xiao, F., Jiang, J., Zhao, Z., and Zhou, X. (2023) Engineered aptamers for molecular imaging, Chem. Sci., 14, 14039-14061, https://doi.org/10.1039/d3sc03989g.

4. Murray, M. T., and Wetmore, S. D. (2024) Unlocking precision in aptamer engineering: a case study of the thrombin binding aptamer illustrates why modification size, quantity, and position matter, Nucleic Acids Res., 52, 10823-10835, https://doi.org/10.1093/nar/gkae729.

5. Plach, M., and Schubert, T. (2020) Biophysical characterization of aptamer-target interactions, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 174, 1-15, https://doi.org/10.1007/10_2019_103.

6. An, Z., Aksoy, O., Zheng, T., Fan, Q. W., and Weiss, W. A. (2018) Epidermal growth factor receptor and EGFRvIII in glioblastoma: signaling pathways and targeted therapies, Oncogene, 37, 1561-1575, https://doi.org/10.1038/s41388-017-0045-7.

7. Sabbah, D. A., Hajjo, R., and Sweidan, K. (2020) Review on epidermal growth factor receptor (EGFR) structure, signaling pathways, interactions, and recent updates of EGFR inhibitors, Curr. Top. Med. Chem., 20, 815-834, https://doi.org/10.2174/1568026620666200303123102.

8. Li, N., Larson, T., Nguyen, H. H., Sokolov, K. V., and Ellington, A. D. (2010) Directed evolution of gold nanoparticle delivery to cells, Chem. Commun. (Camb), 46, 392-394, https://doi.org/10.1039/b920865h.

9. Li, N., Nguyen, H. H., Byrom, M., and Ellington, A. D. (2011) Inhibition of cell proliferation by an anti-EGFR aptamer, PLoS One, 6, e20299, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0020299.

10. Cruz Da Silva, E., Foppolo, S., Lhermitte, B., Ingremeau, M., Justiniano, H., Klein, L., Chenard, M. P., Vauchelles, R., Abdallah, B., Lehmann, M., Etienne-Selloum, N., Dontenwill, M., and Choulier, L. (2022) Bioimaging nucleic-acid aptamers with different specificities in human glioblastoma tissues highlights tumoral heterogeneity, Pharmaceutics, 14, 1980, https://doi.org/10.3390/pharmaceutics14101980.

11. Avutu, V. (2010) Avidity effects of MinE07, an anti-EGFR aptamer, on binding to A431 cells, The University of Texas at Austin Texas ScholarWorks, URL: https://repositories.lib.utexas.edu/items/fbdce8b0-71cf-4422-a5c2-16c7e5695544.

12. Cheng, S., Jacobson, O., Zhu, G., Chen, Z., Liang, S. H., Tian, R., Yang, Z., Niu, G., Zhu, X., and Chen, X. (2019) PET imaging of EGFR expression using an 18F-labeled RNA aptamer, Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging, 46, 948-956, https://doi.org/10.1007/s00259-018-4105-1.

13. Paul, A. R., Falsaperna, M., Lavender, H., Garrett, M. D., and Serpell, C. J. (2023) Selection of optimised ligands by fluorescence-activated bead sorting, Chem. Sci., 14, 9517-9525, https://doi.org/10.1039/d3sc03581f.

14. Esposito, C. L., Passaro, D., Longobardo, I., Condorelli, G., Marotta, P., Affuso, A., de Franciscis, V., and Cerchia, L. (2011) A neutralizing RNA aptamer against EGFR causes selective apoptotic cell death, PLoS One, 6, e24071, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0024071.

15. Wang, D. L., Song, Y. L., Zhu, Z., Li, X. L., Zou, Y., Yang, H. T., Wang, J. J., Yao, P. S., Pan, R. J., Yang, C. J., and Kang, D. Z. (2014) Selection of DNA aptamers against epidermal growth factor receptor with high affinity and specificity, Biochem. Biophys. Res. Commun., 453, 681-685, https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2014.09.023.

16. Wu, X., Liang, H., Tan, Y., Yuan, C., Li, S., Li, X., Li, G., Shi, Y., and Zhang, X. (2014) Cell-SELEX aptamer for highly specific radionuclide molecular imaging of glioblastoma in vivo, PLoS One, 9, e90752, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0090752.

17. Zavyalova, E., Turashev, A., Novoseltseva, A., Legatova, V., Antipova, O., Savchenko, E., Balk, S., Golovin, A., Pavlova, G., and Kopylov, A. (2020) Pyrene-modified DNA aptamers with high affinity to wild-type EGFR and EGFRvIII, Nucleic Acid Ther., 30, 175-187, https://doi.org/10.1089/nat.2019.0830.

18. Kim, K., Lee, S., Ryu, S., and Han, D. (2014) Efficient isolation and elution of cellular proteins using aptamer-mediated protein precipitation assay, Biochem. Biophys. Res. Commun., 448, 114-119, https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2014.04.086.

19. Damase, T. R., Miura, T. A., Parent, C. E., and Allen, P. B. (2018) Application of the open qPCR instrument for the in vitro selection of DNA aptamers against epidermal growth factor receptor and Drosophila C virus, ACS Comb. Sci., 20, 45-54, https://doi.org/10.1021/acscombsci.7b00138.

20. Damase, T. R., and Allen, P. B. (2019). Idiosyncrasies of thermofluorimetric aptamer binding assays, BioTechniques, 66, 121-127, https://doi.org/10.2144/btn-2018-0128.

21. Il’in, V. A., Pyzhik, E. V., Balakhonov, A. B., Kiryushin, M. A., Shcherbatova, E. V., Kuznetsov, A. A., Kostin, P. A., Golovin, A. V., Korshun, V. A., Brylev, V. A., Sapozhnikova, K. A., Kopylov, A. M., Pavlova, G. V., and Pronin, I. N. (2022) Radiochemical synthesis of 4-[18F]FluorobenzylAzide and its conjugation with EGFR-specific aptamers, Molecules, 28, 294, https://doi.org/10.3390/molecules28010294.

22. Mathews, D. H., Disney, M. D., Childs, J. L., Schroeder, S. J., Zuker, M., and Turner, D. H. (2004) Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 7287-7292, https://doi.org/10.1073/pnas.0401799101.

23. Reuter, J. S., and Mathews, D. H. (2010) RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis, BMC Bioinformatics, 11, 129, https://doi.org/10.1186/1471-2105-11-129.

24. SantaLucia J., Jr. (1998) A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 95, 1460-1465, https://doi.org/10.1073/pnas.95.4.1460.

25. SantaLucia, J., Jr., and Hicks, D. (2004) The thermodynamics of DNA structural motifs, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 33, 415-440, https://doi.org/10.1146/annurev.biophys.32.110601.141800.

26. Hirka, S., and McKeague, M. (2021) Quantification of aptamer-protein binding with fluorescence anisotropy, Aptamers, 5, 1-6, https://doi.org/10.13140/RG.2.2.13355.57124.

27. Weaver, S. D., and Whelan, R. J. (2021) Characterization of DNA aptamer-protein binding using fluorescence anisotropy assays in low-volume, high-efficiency plates, Anal. Methods, 13, 1302-1307, https://doi.org/10.1039/d0ay02256j.

28. O’Shannessy, D. J., Brigham-Burke, M., Soneson, K. K., Hensley, P., and Brooks, I. (1993) Determination of rate and equilibrium binding constants for macromolecular interactions using surface plasmon resonance: use of nonlinear least squares analysis methods, Anal. Biochem., 212, 457-468, https://doi.org/10.1006/abio.1993.1355.

29. Cao, Z., and Tan, W. (2005) Molecular aptamers for real-time protein-protein interaction study, Chemistry, 11, 4502-4508, https://doi.org/10.1002/chem.200400983.

30. Ferré-D’Amaré, A. R., and Doudna, J. A. (1999) RNA folds: insights from recent crystal structures, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 28, 57-73, https://doi.org/10.1146/annurev.biophys.28.1.57.

31. Sarkar, R., Mainan, A., and Roy, S. (2024) Influence of ion and hydration atmospheres on RNA structure and dynamics: insights from advanced theoretical and computational methods, Chem. Commun. (Camb), 60, 3624-3644, https://doi.org/10.1039/d3cc06105a.

32. Zhao, Q., Tao, J., Feng, W., Uppal, J. S., Peng, H., and Le, X. C. (2020) Aptamer binding assays and molecular interaction studies using fluorescence anisotropy – a review, Anal. Chim. Acta, 1125, 267-278, https://doi.org/10.1016/j.aca.2020.05.061.

33. Jha, R., Gorai, P., Shrivastav, A., and Pathak, A. (2024) Label-free biochemical sensing using processed optical fiber interferometry: a review, ACS Omega, 9, 3037-3069, https://doi.org/10.1021/acsomega.3c03970.