Полноразмерный репликон SARS‑CoV‑2 с двумя репортерами для скрининга ингибиторов РНК‑зависимой РНК‑полимеразы вируса

Аннотация

В качестве безопасной клеточной системы для тестирования ингибиторов РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) SARS‑CoV‑2 получена генетическая конструкция, клонированная в вектор искусственной бактериальной хромосомы и представляющая собой кДНК вируса, не содержащую генов структурных белков S, E и M, с двумя блоками репортерных генов. Первый блок, представленный люциферазой Renilla reniformis и зелёным флуоресцентным белком (Rluc–GFP), находится под контролем CMV-промотора, расположенного перед 5′‑нетранслируемым регионом (5′‑UTR) SARS‑CoV‑2. Второй блок репортерных генов представлен люциферазой светлячка Photinus pyralis и красным флуоресцентным белком (Fluc–RFP) и находится после последовательности, регулирующей транскрипцию (TRS‑N). Такое расположение генов и регуляторных последовательностей позволяет оценить уровень ингибирования вирусной RdRp, поскольку первый блок репортерных генов может транскрибироваться не только вирусной RdRp, но и клеточными полимеразами, в то время как второй блок может транскрибироваться только вирусной полимеразой по механизму прерывистой транскрипции, характерной для семейства Coronaviridae. Для облегчения поиска нуклеозидных ингибиторов RdRp без создания фосфорилированных депо‑форм создана клеточная линия Vero E6_ТК, экспрессирующая тимидинкиназу вируса простого герпеса, осуществляющую первую стадию фосфорилирования нуклеозидов в клетке. Проверка способности ряда соединений ингибировать каталитическую активность RdRp SARS‑CoV‑2 позволила впервые обнаружить антивирусную активность у 2′‑амино-2′‑дезоксиаденозина и аденозин-N1‑оксида, превышающую активность используемого для лечения COVID‑19 молнупиравира.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Вклад авторов

Концепция – A.Н.А., М.Б.Г., С.П.К., С.Н.К. и А.Л.Х.; методология – А.Н.А., С.О.Г., М.Б.Г., С.П.К. и А.Л.Х.; проведение экспериментов – Л.А.А., А.Н.А., С.О.Г., Е.С.М., М.С.Н., С.П.К., А.Л.Х., А.А.Ш. и М.В.Я.; анализ данных – А.Н.А., С.П.К. и А.А.Ш.; научное руководство – М.Б.Г., С.Н.К. и А.Л.Х.; написание текста – А.Н.А., М.Б.Г., С.П.К., А.Л.Х. и А.А.Ш.; редактирование текста – А.Н.А., М.Б.Г., С.П.К., С.Н.К. и А.Л.Х.; привлечение финансирования – С.Н.К. Все авторы прочитали текст статьи и согласны на её публикацию.

Финансирование

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации («Аналоги компонентов нуклеиновых кислот как потенциальные ингибиторы коронавирусов»).

Благодарности

Лентивирусный вектор, кодирующий тимидинкиназу вируса простого герпеса первого типа, был любезно предоставлен к.б.н., н.с. Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН И.В. Алексеенко. Отбор клеток Vero E6_TK проводили под руководством д.х.н., проф. химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова М.П. Рубцовой с помощью сортировки GFP+ клеток на проточном цитофлуориметре BD FACSAria III, приобретённом по Программе развития МГУ имени М.В. Ломоносова ПНР 5.13.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Amani, B., and Amani, B. (2023) Efficacy and safety of nirmatrelvir/ritonavir (Paxlovid) for COVID-19: A rapid review and meta-analysis, J. Med. Virol., 95, e28441, https://doi.org/10.1002/jmv.28441.

2. Sola, I., Almazan, F., Zuniga, S., and Enjuanes, L. (2015) Continuous and discontinuous RNA synthesis in coronaviruses, Annu. Rev. Virol., 2, 265-288, https://doi.org/10.1016/S0065-3527(06)66005-3.

3. Masters, P. S. (2006) The molecular biology of coronaviruses, Adv. Virus Rev., 66, 193-292, https://doi.org/10.1016/S0065-3527(06)66005-3.

4. Kurhade, C., Xie, X., and Shi, P.-Y. (2023) Reverse genetic systems of SARS-CoV-2 for antiviral research, Antiviral Res., 210, 105486, https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2022.105486.

5. Галкин С. О., Анисенко А. Н., Шадрина О. А., Готтих М. Б. (2022) Генно-инженерные системы для изучения вирусных патогенов человека из семейства Coronaviridae, Мол. Биол., 56, 82-102, https://doi.org/10.31857/S0026898422010025.

6. Chiem, K., Ye, C., and Martinez-Sobrido, L. (2020) Generation of recombinant SARS-CoV-2 using a bacterial artificial chromosome, Curr. Protoc. Microbiol., 59, e126, https://doi.org/10.1002/cpmc.126.

7. Chiem, K., Park, J., Morales Vasquez, D., Plemper, R. K., Torrelles, J. B., Kobie, J. J., Walter, M. R., Ye, C., and Martinez-Sobrido, L. (2022) Monitoring SARS-CoV-2 infection using a double reporter-expressing virus, Microbiol. Spect., 10, e0237922, https://doi.org/10.1128/spectrum.02379-22.

8. Ye, C., and Martinez-Sobrido, L. (2022) Use of a bacterial artificial chromosome to generate recombinant SARS-CoV-2 expressing robust levels of reporter genes, Microbiol. Spectr., 10, e0273222, https://doi.org/10.1128/spectrum.02732-22.

9. Chiem, K., Morales Vasquez, D., Park, J. G., Platt, R. N., Anderson, T., Walter, M. R., Kobie, J. J., Ye, C., and Martinez-Sobrido, L. (2021) Generation and Characterization of recombinant SARS-CoV-2 expressing reporter genes, J. Virol. 95, e0220920, https://doi.org/10.1128/JVI.02209-20.

10. Jin, Y.-Y., Lin, H., Cao, L., Wu, W.-C., Ji, Y., Du, L., Jiang, Y., Xie, Y., Tong, K., Xing, F., Zheng, F., Shi, M., Pan, J.-A., Peng, X., and Guo, D. (2021) A convenient and biosafe replicon with accessory genes of SARS-CoV-2 and its potential application in antiviral drug discovery, Virol. Sin., 36, 913-923, https://doi.org/10.1007/s12250-021-00385-9.

11. Zhang, Q. Y., Deng, C. L., Liu, J., Li, J. Q., Zhang, H. Q., Li, N., Zhang, Y. N., Li, X. D., Zhang, B., Xu, Y., and Ye, H. Q. (2021) SARS-CoV-2 replicon for high-throughput antiviral screening, J. Gen. Virol., 102, 001583, https://doi.org/10.1099/jgv.0.001583.

12. Kotaki, T., Xie, X., Shi, P. Y., and Kameoka, M. (2021) A PCR amplicon-based SARS-CoV-2 replicon for antiviral evaluation, Sci. Rep., 11, 2229, https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2022.105486.

13. Wang, B., Zhang, C., Lei, X., Ren, L., Zhao, Z., Wang, J., and Huang, H. (2021) Construction of non-infectious SARS-CoV-2 replicons and their application in drug evaluation, Virol. Sin., 36, 5, 890-900, https://doi.org/10.1007/s12250-021-00369-9.

14. He, X., Quan, S., Xu, M., Rodriguez, S., Goh, S. L., Wei, J., Fridman, A., Koeplinger, K. A., Carroll, S. S., Grobler, J. A., Espeseth, A. S., Olsen, D. B., Hazuda, D. J., and Wang, D. (2021) Generation of SARS-CoV-2 reporter replicon for high-throughput antiviral screening and testing, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 118, e2025866118, https://doi.org/10.1073/pnas.2025866118.

15. Luo, Y., Yu, F., Zhou, M., Liu, Y., Xia, B., Zhang, X., Liu, J., Zhang, J., Du, Y., Li, R., Wu, L., Zhang, X., Pan, T., Guo, D., Peng, T., and Zhang, H. (2021) Engineering a reliable and convenient SARS-CoV-2 replicon system for analysis of viral RNA synthesis and screening of antiviral inhibitors, mBio, 12, e02754-20, https://doi.org/10.1128/mBio.02754-20.

16. Kwong, C. D., Krauth, C. A., Shortnacy-Fowler, A. T., Arnett, G., Hollingshead, M. G., Shannon, W. M., Montgomery, J. A., and Secrist, J. A. III (1998) Synthesis and antiviral evaluation of analogs of adenosine-N¹-oxide and 1-(benzyloxy)adenosine, Nucleosid. Nucleotid., 17, 1409-1443, https://doi.org/10.1080/07328319808003478.

17. Alexandrova, L. A., and Smrt, J. (1977) Synthesis of cytidylyl-(3′->5′)-2′-O(and 3′-O)-methyladenosine 3′-O(and 2′-O)-N-formyl-L-methionyl derivatives, Collection Czech. Chem. Commun., 42, 1694-1704, https://doi.org/10.1135/cccc19771694.

18. Шаркин Ю. А., Ясько М. В., Скоблов А. Ю., Александрова Л. А. (1996) Синтез 5′-H-фосфонатов и фторфосфатов 2′-модифицированных нуклеозидов, Биоорг. Хим., 22, 297-302.

19. Klimenko, A., Matyugina, E., Logashenko, E., Solyev, P., Zenkova, M., Kochetkov, S., and Khandazhinskaya, A. (2018) Novel 5′-norcarbocyclic derivatives of bicyclic pyrrolo-and furano[2,3-d]pyrimidine nucleosides, Molecules, 23, 2654, https://doi.org/10.3390/molecules23102654.

20. Siniavin, A. E., Novikov, M. S., Gushchin, V. A., Terechov, A. A., Ivanov, I. A., Paramonova, M. P., Gureeva, E. S., Russu, L. I., Kuznetsova, N. A., Shidlovskaya, E. V., Luyksaar, S. I., Vasina, D. V., Zolotov, S. A., Zigangirova, N. A., Logunov, D. A., and Gintsburg, A. L. (2022) Antiviral activity of N1,N3-disubstituted uracil derivatives against SARS-CoV-2 variants of concern, Int. J. Mol. Sci., 23, 10171, https://doi.org/10.3390/ijms231710171.

21. Wang, Y., Wang, F., Wang, R., Zhao, P., and Xia, Q. (2015) 2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori, Sci. Rep., 5, 16273, https://doi.org/10.1038/srep16273.

22. Almazan, F., DeDiego, M. L., Galan, C., Escors, D., Alvarez, E., Ortego, J., Sola, I., Zuniga, S., Alonso, S., Moreno, J. L., Nogales, A., Capiscol, C., and Enjuanes, L. (2006) Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis, J. Virol., 80, 10900-10906, https://doi.org/10.1128/JVI.00385-06.

23. Ye, C., Chiem, K., Park, J.-G., Oladunni, F., Platt, R. N., Anderson, T., and Martinez-Sobrido, L. (2020) Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome, mBio, 11, e02168-20, https://doi.org/10.1128/mbio.02168-20.

24. Wright, D. A., Thibodeau-Beganny, S., Sander, J. D., Winfrey, R. J., Hirsh, A. S., Eichtinger, M., Fu, F., Porteus, M. H., Dobbs, D., Voytas, D. F., and Joung, J. K. (2006) Standardized reagents and protocols for engineering zinc finger nucleases by modular assembly, Nat. Protoc., 1, 1637-1652, https://doi.org/10.1038/nprot.2006.259.

25. Gao, Y., Yan, L., Huang, Y., Liu, F., Zhao, Y., Cao, L., Wang, T., Sun, Q., Ming, Z., Zhang, L., Ge, J., Zheng, L., Zhang, Y., Wang, H., Zhu, Y., Zhu, C., Hu, T., Hua, T., Zhang, B., Yang, X., Li, J., Yang, H., Liu, Z., Xu, W., Guddat, L. W., Wang, Q., Lou, Z., and Rao, Z. (2020) Structure of the RNA-dependent RNA polymerase from COVID-19 virus, Science, 368, 779-782, https://doi.org/10.1126/science.abb7498.

26. Emeny, J. M., and Morgan, M. J. (1979) Regulation of the interferon system: evidence that Vero cells have a genetic defect in interferon production, J. Gen. Virol., 43, 247-252, https://doi.org/10.1099/0022-1317-43-1-247.

27. Chew, T., Noyce, R., Collins, S. E., Hancock, M. H., and Mossman, K. L. (2009) Characterization of the interferon regulatory factor 3-mediated antiviral response in a cell line deficient for IFN production, Mol. Immunol., 46, 393-399, https://doi.org/10.1016/j.molimm.2008.10.010.

28. Guettari, N., Loubiere, L., Brisson., E., and Klatzmann, D. (1997) Use of herpes simplex virus thymidine kinase to improve the antiviral activity of zidovudine, Virology, 235, 398-405, https://doi.org/10.1006/viro.1997.8706.

29. Tian, L., Pang, Z., Li, M., Lou, F., An, X., Zhu, S., Song, L., Tong, Y., Fan, H., Fan, J. (2022) Molnupiravir and its antiviral activity against COVID-19, Front. Immunol., 13, 855496, https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.855496.

30. Elion, G. B., Furman, P. A., Fyfe, J. A., De Miranda, P., Beauchamp, L., and Schaeffer, H. J. (1977) Selectivity of action of an antiherpetic agent, 9-(2-hydroxyethoxymethyl) guanine, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5716-5720, https://doi.org/10.1073/pnas.74.12.5716.

31. Freeman, S., and Gardiner, J. M. (1996) Acyclic nucleosides as antiviral compounds, Mol. Biotechnol., 5, 125-137, https://doi.org/10.1007/BF02789061.

32. Hurst, M., and Noble, S. (1999) Stavudine: an update of its use in the treatment of HIV infection, Drugs, 58, 919-949, https://doi.org/10.2165/00003495-199958050-00012.

33. Матюгина Е. С., Новиков М. С., Козловская Л. И., Волок В. П., Шустова Е. Ю., Ишмухаметов А. А., Кочетков С. Н., Хандажинская А. Л. (2021) Оценка противовирусного потенциала модифицированных гетероциклических оснований и 5′-норкарбоциклических аналогов нуклеозидов в отношении SARS-CoV-2, Acta Naturae, 13, 78-81, https://doi.org/10.32607/actanaturae.11479.

34. Lai, M. M., and Cavanagh, D. (1997) The molecular biology of coronaviruses, Adv. Virus Res., 48, 1-100, https://doi.org/10.1016/S0065-3527(08)60286-9.

35. Shizuya, H., Birren, B., Kim, U. J., Mancino, V., Slepak, T., Tachiiri, Y., and Simon, M. (1992) Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 8794-8797, https://doi.org/10.1073/pnas.89.18.8794.

36. Adler, H., Messerle, M., and Koszinowski, U. H. (2003) Cloning of herpesviral genomes as bacterial artificial chromosomes, Rev. Med. Virol., 13, 111-121, https://doi.org/10.1002/rmv.380.

37. Singh, A. K., and Das, K. (2022) Insights into HIV-1 reverse transcriptase (RT) inhibition and drug resistance from thirty years of structural studies, Viruses, 14, 1027, https://doi.org/10.3390/v14051027.

38. Lisco, A., Vanpouille, C., Tchesnokov, E. P., Grivel, J. C., Biancotto, A., Brichacek, B., Elliott, J., Fromentin, E., Shattock, R., Anton, P., Gorelick, R., Balzarini, J., McGuigan, C., Derudas, M., Gotte, M., Schinazi, R. F., and Margolis, L. (2008) Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues, Cell Host Microbe, 4, 260-270, https://doi.org/10.1016/j.chom.2008.07.008.

39. Jockusch, S., Tao, C., Li, X., Anderson, T. K., Chien, M., Kumar, S., Russo, J. J., Kirchdoerfer, R. N., and Ju, J. (2020) A library of nucleotide analogues terminate RNA synthesis catalyzed by polymerases of coronaviruses that cause SARS and COVID-19, Antiviral Res., 180, 104857, https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2020.104857.

40. Huang, P., Farquhar, D., and Plunkett, W. (1992) Selective action of 2’,3’-didehydro-2’,3’-dideoxythymidinetriphosphate on human immunodeficiency virus reverse transcriptase and human DNA polymerases, J. Biol. Chem., 267, 2817-2822.

41. Matyugina, E., Petushkov, I., Surzhikov, S., Kezin, V., Maslova, A., Ivanova, O., Smirnova, O., Kirillov, I., Fedyakina, I., Kulbachinskiy, A., Kochetkov, S., and Khandazhinskaya, A. (2023) Nucleoside analogs that inhibit SARS-CoV-2 replication by blocking interaction of virus polymerase with RNA, Int. J. Mol. Sci., 24, 3361, https://doi.org/10.3390/ijms24043361.