Функциональный анализ генов канальных родопсинов зеленых водорослей Беломорского бассейна

Аннотация

Оптогенетика как метод светоуправляемой регуляции клеточных процессов базируется на применении канальных родопсинов, напрямую генерирующих фотоиндуцированные токи. Наибольшее количество генов канальных родопсинов идентифицировано у зеленых микроводорослей Chlorophyta, и запрос на увеличение числа функционально охарактеризованных канальных родопсинов и разнообразие их фотохимических параметров постоянно растет. Мы провели экспрессионный анализ генов катионных канальных родопсинов (CCR) в природных изолятах микроводорослей родов Haematococcus и Bracteacoccus из уникальной зоны Полярного круга. Обнаруженный полноразмерный CCR транскрипт Haematococcus lacustris является продуктом альтернативного сплайсинга и кодирует белок Hl98CCR2, не обладающий фотохимической активностью. 5′‑Концевой фрагмент транскрипта CCR Bracteacoccus aggregatus кодирует белок Ba34CCR, содержащий консервативный мембранный домен ТМ1–ТМ7 и короткий участок цитозольного фрагмента. При гетерологичной экспрессии фрагмента ТМ1–ТМ7 в культуре клеток СНО‑К1 наблюдалась светозависимая генерация тока, параметры которого соответствуют характеристикам CCR. Впервые обнаруженный функциональный канальный родопсин Bracteacoccus не имеет близких гомологов CCR и может представлять интерес в качестве кандидата для оптогенетики.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Вклад авторов

Е.С. Лобакова, О.В. Карпова, Д.В. Абрамочкин – концепция и руководство работой; Е.Н. Виноградова, О.В. Карпова, А.М. Мойсенович, О.Б. Пустовит, А.А. Рамонова – проведение экспериментов; Е.С. Лобакова, О.В. Карпова, Д.В. Абрамочкин – обсуждение результатов исследования; О.В. Карпова, Д.В. Абрамочкин – написание текста; Е.С. Лобакова, Д.В. Абрамочкин – редактирование текста статьи.

Финансирование

Исследование выполнено при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках соглашения № 075-15-2021-1396 от 26.10.2021 г. Работы по ДНК-секвенированию проведены в рамках выполнения государственного задания НИЦ «Курчатовский институт».

Благодарности

Авторы выражают благодарность Т.А. Федоренко (МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва) за предоставление культур и рекомендации по выращиванию, Центру старения МФТИ (г. Долгопрудный) за предоставленный экспрессионный вектор pcDNA3.1 eYFP, а также Е.Г. Максимову (МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва) за предоставленный измеритель интенсивности излучения. В работе использовали оборудование, приобретенное в рамках «Программы развития Московского университета до 2020 года», и оборудование ЦКП МГУ имени М.В. Ломоносова.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., and Spudich, J. L. (2022) Emerging diversity of channelrhodopsins and their structure-function relationships, Front. Cell. Neurosci., 15, 800313, https://doi.org/10.3389/fncel.2021.800313.

2. Sineshchekov, O. A., Govorunova, E. G., Der, A., Keszthelyi, L., and Nultsch, W. (1992) Photoelectric responses in phototactic flagellated algae measured in cell suspension, J. Photochem. Photobiol. B Biol., 13, 119-134, https://doi.org/10.1016/1011-1344(92)85051-U.

3. Sineshchekov, O. A., Jung, K.-H., and Spudich, J. L. (2002) Two rhodopsins mediate phototaxis to low- and high-intensity light in Chlamydomonas reinhardtii, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 8689-8694, https://doi.org/10.1073/pnas.122243399.

4. Govorunova, E. G., Jung, K.-W., Sineshchekov, O. A., and Spudich, J. L. (2004) Chlamydomonas sensory rhodopsins A and B: cellular content and role in photophobic responses, Biophys. J., 86, 2342-2349, https://doi.org/10.1016/S0006-3495(04)74291-5.

5. Deisseroth, K. (2015) Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience, Nat. Neurosci., 18, 1213-1225, https://doi.org/10.1038/nn.4091.

6. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Li, H., Wang, Y., Brown, L. S, Palmateer, A., Melkonian, M., Cheng, S., Carpenter, E., Patterson, J., Wong, G. K., and Spudich, J. L. (2021) Cation and anion channelrhodopsins: sequence motifs and taxonomic distribution, mBio, 12, e0165621, https://doi.org/10.1128/mBio.01656-21.

7. Карпова О. В., Виноградова E. Н., Лобакова Е. С. (2022) Идентификация генов канальных родопсинов в зеленых и криптофитовых водорослях Белого и Черного морей, Биохимия, 87, 1492-1504, https://doi.org/10.31857/S0320972522100141.

8. Galietta, L. J., Haggie, P. M., and Verkman, A. S. (2001) Green fluorescent protein-based halide indicators with improved chloride and iodide affinities, FEBS Lett., 499, 220-224, https://doi.org/10.1016/s0014-5793(01)02561-3.

9. Hou, S. Y., Govorunova, E. G., Ntefidou, M., Lane, C. E., Spudich, E. N., Sineshchekov, O. A., Spudich, J. L. (2012) Diversity of Chlamydomonas channelrhodopsins, Photochem. Photobiol., 88, 119-128, https://doi.org/10.1111/j.1751-1097.2011.01027.x.

10. Klapoetke, N. C., Murata, Y., Kim, S. S., Pulver, S. R., Birdsey-Benson, A., Cho, Y. K., Morimoto, T. K., Chuong, A. S., Carpenter, E. J., Tian, Z., Wang, J., Xie, Y., Yan, Z., Zhang, Y., Chow, B. Y., Surek, B., Melkonian, M., Jayaraman, V., Constantine-Paton, M., Wong, G. K., and Boyden, E. S. (2014) Independent optical excitation of distinct neural populations, Nat. Methods, 11, 338-346, https://doi.org/10.1038/nmeth.2836.

11. Rozenberg, A., Oppermann, J., Wietek, J., Fernandez Lahore, R. G., Sandaa, R. A., Bratbak, G., Hegemann, P., and Béjà, O. (2020) Lateral gene transfer of anion-conducting channelrhodopsins between green algae and giant viruses, Curr. Biol., 30, 4910-4920, https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.09.056.

12. Nagel, G., Ollig, D., Fuhrmann, M., Kateriya, S., Musti, A. M., Bamberg, E., and Hegemann, P. (2002) Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae, Science, 296, 2395-2398, https://doi.org/10.1126/science.1072068.

13. Nagel, G., Szellas, T., Huhn, W., Kateriya, S., Adeishvili, N., Berthold, P., Ollig, D., Hegemann, P., and Bamberg E. (2003) Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 13940-13945, https://doi.org/10.1073/pnas.1936192100.

14. Говорунова Е. Г., Синещеков О. А. (2023) Канальные родопсины: от фототаксиса к оптогенетике, Биохимия, 88, 1880-1897, https://doi.org/10.1134/S000629792310015.

15. Hososhima, S., Ueno, S., Okado, S., Inoue, K., and Konno, M. (2023) A light-gated cation channel with high reactivity to weak light, Sci. Rep., 13, 7625, https://doi.org/10.1038/s41598-023-34687-7.