Количественный анализ фагоцитоза в цельной крови с применением двойного окрашивания и визуализации

Аннотация

Фагоцитоз – важнейшая функция врождённого иммунитета человека и животных. Снижение способности к фагоцитозу связано со многими заболеваниями и старением иммунной системы. Определение фагоцитарной динамики клеток требует количественной оценки бактерий внутри и снаружи фагоцита. Хотя проточная цитометрия является наиболее распространённым методом оценки фагоцитоза, её использование не предполагает визуализации и прямой количественной оценки пространственной локализации бактерий. В данном исследовании применяли методы проточной цитометрии (сортировки) и конфокальной микроскопии в сочетании с «двухцветной» маркировкой бактерий Escherichia coli, которые использовали как объект фагоцитоза. Для обеспечения высокой производительности количественного и пространственного распознавания двухцветных E. coli, ассоциированных с фагоцитами, также применяли проточную цитометрию с визуализацией в потоке. На основании полученных данных было сделано предположение о важной роли удержания патогенов на поверхности миелоидных и лимфоидных клеток без последующей интернализации. Разработанный метод бактериальной конъюгации существенно повысил точность количественной и пространственной оценки фагоцитоза и может быть рекомендован в качестве вспомогательного подхода при использовании проточных цитометров с визуализацией для анализа фагоцитоза в цельной крови.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Дополнительные материалы

Приложение

Вклад авторов

Е.В. Лысакова, А.Н. Шумеев, С.А. Чувпило, В.С. Лактюшкин, Н.А. Арсентьева – проведение экспериментов; Е.В. Лысакова, Н.А. Арсентьева, А.Н. Шумеев, С.А. Рыбцов – обсуждение результатов исследования; Е.В. Лысакова, Н.А. Арсентьева, А.Н. Шумеев, М.Ю. Бобров, В.С. Лактюшкин – обсчёт и анализ результатов исследований; Е.В. Лысакова, С.А. Рыбцов – написание текста; Е.В. Лысакова, А.Н. Шумеев, С.А. Чувпило, В.С. Лактюшкин, Н.А. Арсентьева, М.Ю. Бобров, С.А. Рыбцов – редактирование текста статьи; С.А. Рыбцов – концепция и руководство работой.

Финансирование

Работа по анализу фагоцитоза с использованием проточной цитометрии и конфокальной микроскопии, а также анализ результатов и подготовка рукописи были выполнены Лысаковой Е.В., Шумеевым А.Н. и Рыбцовым С.А. при поддержке Российского научного фонда, проект № 23-15-00443 (https://rscf.ru/project/23-15-00443/). Приготовление бактерий, конъюгированных с двойной меткой, количественный анализ, а также валидация препарата на Amnis FlowSight были выполнены Лысаковой Е.В., Чувпило С.А., Бобровым М.Ю. при финансировании Министерством науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение № 075-10-2021-093; проект НИР-ИМБ-2102).

Благодарности

Благодарим С.А. Недоспасова, О.К. Бацунова и В.В. Зарубаева за содействие в выполнении работы; Лабораторный комплекс Университета «Сириус» и Ресурсный центр клеточной технологии и иммунологии за предоставление оборудования для работы; ЦКП ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера «Цитометрии и биомаркеры» за помощь и предоставление проточного цитометра с визуализаций Amnis FlowSight («Cytek»).

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в финансовой или какой-либо иной сфере.

Соблюдение этических норм

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют национальным этическим стандартам, Хельсинкской декларации 1964 года и её последующим изменениям и одобрены комитетом по биоэтике Университета «Сириус» (протокол от 06.03.2023 г.). Информированное добровольное согласие получено от всех индивидуальных участников исследования до отбора образцов крови.

Список литературы

1. Lancaster, C. E., Ho, C. Y., Hipolito, V. E., Botelho, R. J., and Terebiznik, M. R. (2019) Phagocytosis: what’s on the menu? Biochem. Cell Biol., 97, 21-29, doi: 10.1139/bcb-2018-0008.

2. Carneiro, V. M. A., Bezerra, A. C. B., Guimarães, M. D. C. M., and Muniz-Junqueira, M. I. (2012) Decreased phagocytic function in neutrophils and monocytes from peripheral blood in periodontal disease, J. Appl. Oral Sci., 20, 503-509, doi: 10.1590/s1678-77572012000500002.

3. Singh, R., Belchamber, K. B. R., Fenwick, P. S., Chana, K., Donaldson, G., Wedzicha, J. A., Barnes, P. J., Donnelly, L. E., and COPDMAP consortium (2021) Defective monocyte-derived macrophage phagocytosis is associated with exacerbation frequency in COPD, Respirat. Res., 22, 1-11, doi: 10.1186/s12931-021-01718-8.

4. Nakahashi-Oda, C., Fujiyama, S., Nakazawa, Y., Kanemaru, K., Wang, Y., Lyu, W., Shichita, T., Kitaura, J., and Shibuya, A. (2021) CD300a blockade enhances efferocytosis by infiltrating myeloid cells and ameliorates neuronal deficit after ischemic stroke, Sci. Immunol., 6, eabe7915, doi: 10.1126/sciimmunol.abe7915.

5. Kelley, S. M., and Ravichandran, K. S. (2021) Putting the brakes on phagocytosis: “don’t‐eat‐me” signaling in physiology and disease, EMBO Rep., 22, e52564, doi: 10.15252/embr.202152564.

6. Tang, Z., Davidson, D., Li, R., Zhong, M. C., Qian, J., Chen, J., and Veillette, A. (2021) Inflammatory macrophages exploit unconventional pro-phagocytic integrins for phagocytosis and anti-tumor immunity, Cell Rep., 37, doi: 10.1016/j.celrep.2021.110111.

7. Uribe-Querol, E., Rosales, C. (2017) Control of phagocytosis by microbial pathogens, Front. Immunol., 8, 1368, doi: 10.3389/fimmu.2017.01368.

8. Gagnon, E., Duclos, S., Rondeau, C., Chevet, E., Cameron, P. H., Steele-Mortimer, O., Paiement, J., Bergeron, J. J. M., and Desjardins, M. (2002) Endoplasmic reticulum-mediated phagocytosis is a mechanism of entry into macrophages, Cell, 110, 119-131, doi: 10.1016/s0092-8674(02)00797-3.

9. Dempsey, L. A. (2019) Inhibiting phagocytosis, Nat. Immunol., 20.9, 1089-1089, doi: 10.1038/s41590-019-0485-z.

10. Cruz, F. M., Chan, A., and Rock, K. L. (2023) Pathways of MHC I cross-presentation of exogenous antigens, Semin. Immunol., 66, 101729, doi: 10.1016/j.smim.2023.101729.

11. Porpodis, K., Domvri, K., Zarogoulidis, P., Petridis, D., Tsirgogianni, K., Papaioannou, A., Hatzizisi, O., Kioumis, I., Liaka, A., Kikidaki, V., Lampaki, S., Organtzis, J., and Zarogoulidis, K. (2015) Roflumilast, a phosphodiesterase-4 inhibitor, induces phagocytic activity in Greek COPD patients, Int. J. Chron. Obstruct. Pulmon. Dis., 10, 1123-1128, doi: 10.2147/COPD.S83205.

12. Morais, T. C., Honorio-França, A. C., Fujimori, M., de Quental, O. B., Pessoa, R. S., França, E. L., and de Abreu, L. C. (2019) Melatonin action on the activity of phagocytes from the colostrum of obese women, Medicina, 55, 625, doi: 10.3390/medicina55100625.

13. Garcia‐Seyda, N., Seveau, V., Manca, F., Biarnes‐Pelicot, M., Valignat, M. P., Bajenoff, M., and Theodoly, O. (2021) Human neutrophils swim and phagocytise bacteria, Biol. Cell, 113, 28-38, doi: 10.1111/boc.202000084.

14. Li, W. (2013) Phagocyte dysfunction, tissue aging and degeneration, Ageing Res. Rev., 12, 1005-1012, doi: 10.1016/j.arr.2013.05.006.

15. Ciabattini, A., Nardini, C., Santoro, F., Garagnani, P., Franceschi, C., and Medaglini, D. (2018) Vaccination in the elderly: the challenge of immune changes with aging, Semin. Immunol., 40, 83-94, doi: 10.1016/j.smim.2018.10.010.

16. Robinson, J. P., Carter, W. O., and Narayanan, P. (1997) Functional assays by flow cytometry, in Manual of Clinical Laboratory Immunology. Volume Immune Cell Phenotyping and Flow Cytometric Analysis: Am. Soc. Microbiol. (Rose, Ed., Folds, J. D., Lane, H. C., and Nakumura, R., eds) 5, pp. 245-254.

17. Serrander, L., Skarman, P., Rasmussen, B., Witke, W., Lew, D. P., Krause, K. H., Stendahl, O., and Nüße, O. (2000) Selective inhibition of IgG-mediated phagocytosis in gelsolin-deficient murine neutrophils, J. Immunol., 165, 2451-2457, doi: 10.4049/jimmunol.165.5.2451.

18. Lindner, B., Burkard, T., and Schuler, M. (2020) Phagocytosis assays with different pH-sensitive fluorescent particles and various readouts, Biotechniques, 68, 245-250, doi: 10.2144/btn-2020-0003.

19. Yang, F., Zhang, F., Yang, L., Li, H., and Zhou, Y. (2021) Establishment of the reference intervals of whole blood neutrophil phagocytosis by flow cytometry, J. Clin. Lab. Analysis, 35, e23884, doi: 10.1002/jcla.23884.

20. Jackaman, C., Tomay, F., Duong, L., Razak, N. B. A., Pixley, F. J., Metharom, P., and Nelson, D. J. (2017) Aging and cancer: the role of macrophages and neutrophils, Ageing Res. Rev., 36, 105-116, doi: 10.1016/j.arr.2017.03.008.

21. DeLoid, G. M., Sulahian, T. H., Imrich, A., and Kobzik, L. (2009) Heterogeneity in macrophage phagocytosis of Staphylococcus aureus strains: high-throughput scanning cytometry-based analysis, PLoS One, 4, e6209, doi: 10.1371/journal.pone.0006209.

22. Laitinen, O. H., Kuusela, T. P., Kukkurainen, S., Nurminen, A., Sinkkonen, A., and Hytönen, V. P. (2021) Bacterial avidins are a widely distributed protein family in Actinobacteria, Proteobacteria and Bacteroidetes, BMC Ecol. Evol., 21, 1-14, doi: 10.1186/s12862-021-01784-y.