Влияние нуклеотидного контекста на протекание неспецифической амплификации ДНК под действием ДНК-полимеразы Bst exo-

Институт биохимии и генетики Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук, 450054 Уфа, Башкортостан, Россия

Поступила в редакцию 11.09.2023
После доработки 30.11.2023
Принята к публикации 02.12.2023

DOI: 10.31857/S0320972524010039

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ДНК-полимераза Bst exo-, изотермическая амплификация, мультимеризация, специфичность, молекулярный докинг.

Аннотация

В последние годы всё большее распространение приобретают методы амплификации нуклеиновых кислот, протекающие в изотермическом режиме и требующие использования ДНК-полимераз с цепь-вытесняющей активностью. Среди таковых наиболее популярной является полимераза Bst exo-, однако она склонна вести неспецифический синтез ДНК посредством мультимеризации. В данной работе показано влияние нуклеотидной последовательности на прочность связывания Bst exo- с ДНК и на эффективность запуска мультимеризации. На моделях одноцепочечных тринуклеотидов (sst) и динуклеотидных дуплексов (dst) методом молекулярного докинга выявлена предпочтительность связывания «закрытой» формы Bst exo- с пурин-богатыми последовательностями, особенно содержащими dG на 3′-конце растущей цепи. Данные, полученные in silico, подтверждены в экспериментах с использованием олигонуклеотидных матриц, различающихся структурой 3′- и 5′-концевых мотивов. Показано, что матрицы с олигопуриновым 3′-концевым фрагментом и олигопиримидиновой 5′-концевой частью способствуют более раннему запуску мультимеризации. Полученные данные могут быть использованы на этапе выбора оптимальных нуклеотидных последовательностей для изотермической амплификации, обеспечивающих получение более достоверных результатов. Так, для исключения мультимеризации следует избегать ДНК-матриц и праймеров, содержащих концевые нуклеотиды dA и/или dG.

Текст статьи

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Вклад авторов

Р.Р. Гарафутдинов – концепция и общее руководство работой, проведение экспериментов, оформление конечного варианта статьи; О.Ю. Купова – проведение in silico исследований, обработка, анализ и обсуждение результатов; А.Р. Сахабутдинова – проведение экспериментов, обсуждение результатов, написание статьи.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 22-24-00235).

Благодарности

В работе использовано оборудование Регионального центра коллективного пользования «Агидель» и Центра коллективного пользования «Биомика».

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Бодулев О. Л., Сахаров И. Ю. (2020) Изотермические методы амплификации нуклеиновых кислот и их применение в биоанализе, Биохимия, 85, 174-196, https://doi.org/10.31857/S0320972520020037.

2. Soroka, M., Wasowicz, B., and Rymaszewska, A. (2021) Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): the better sibling of PCR? Cells, 10, 1931, https://doi.org/10.3390/cells10081931.

3. Гарафутдинов Р. Р., Сахабутдинова А. Р., Гильванов А. Р., Чемерис А. В. (2021) Амлификация нуклеиновых кислот «катящимся кольцом» – универсальный метод анализа широкого круга биологических мишеней, Биоорг. Химия, 47, 721-740, https://doi.org/10.31857/S0132342321060075.

4. Kuznetsova, A. A., Fedorova, O. S., and Kuznetsov, N. A. (2022) Structural and molecular kinetic features of activities of DNA polymerases, Int. J. Mol. Sci., 23, 6373, https://doi.org/10.3390/ijms23126373.

5. Oscorbin, I., and Filipenko, M. (2023) Bst polymerase – a humble relative of Taq polymerase, Comput. Struct. Biotechnol. J., 21, 4519-4535, https://doi.org/10.1016/j.csbj.2023.09.008.

6. Hafner, G. J., Yang, I. C., Wolter, L. C., Stafford, M. R., and Giffard, P. M. (2001) Isothermal amplification and multimerization of DNA by Bst DNA polymerase, BioTechniques, 30, 852-886, https://doi.org/10.2144/01304rr03.

7. Garafutdinov, R. R., Gilvanov, A. R., and Sakhabutdinova, A. R. (2020) The influence of reaction conditions on DNA multimerization during isothermal amplification with Bst DNA polymerase, Appl. Biochem. Biotechnol., 190, 758-771, https://doi.org/10.1007/s12010-019-03127-6.

8. Wang, G., Ding, X., Hu, J., Wu, W., Sun, J., and Mu, Y. (2017) Unusual isothermal multimerization and amplification by the strand-displacing DNA polymerases with reverse transcription activities, Sci. Rep., 7, 13928, https://doi.org/10.1038/s41598-017-13324-0.

9. Sakhabutdinova, A. R., Kamalov, M. I., Salakhieva, D. V., Mavzyutov, A. R., and Garafutdinov, R. R. (2021) Inhibition of nonspecific polymerase activity using poly(aspartic) acid as a model anionic polyelectrolyte, Anal. Biochem., 628, 114267, https://doi.org/10.1016/j.ab.2021.114267.

10. Зырина Н. В., Антипова В. Н. (2021) Неспецифический синтез нуклеиновых кислот в реакциях изотермической амплификации, Биохимия, 86, 1066-1077, https://doi.org/10.31857/S0320972521070101.

11. Rolando, J. C., Jue, E., Barlow, J. T., and Ismagilov, R. F. (2020) Real-time kinetics and high-resolution melt curves in single-molecule digital LAMP to differentiate and study specific and non-specific amplification, Nucleic Acids Res., 48, e42, https://doi.org/10.1093/nar/gkaa099.

12. Reid, M. S., Le, X. C., and Zhang, H. (2018) Exponential isothermal amplification of nucleic acids and assays for proteins, cells, small molecules, and enzyme activities: an EXPAR example, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 57, 11856-11866, https://doi.org/10.1002/anie.201712217.

13. Tan, E., Erwin, B., Dames, S., Ferguson, T., Buechel, M., Irvine, B., Voelkerding, K., and Niemz, A. (2008) Specific versus nonspecific isothermal DNA amplification through thermophilic polymerase and nicking enzyme activities, Biochemistry, 47, 9987-9999, https://doi.org/10.1021/bi800746p.

14. Qian, J., Ferguson, T. M., Shinde, D. N., Ramírez-Borrero, A. J., Hintze, A., Adami, C., and Niemz, A. (2012) Sequence dependence of isothermal DNA amplification via EXPAR, Nucleic Acids Res., 40, e87, https://doi.org/10.1093/nar/gks230.

15. Garafutdinov, R. R., Sakhabutdinova, A. R., Kupryushkin, M. S., and Pyshnyi, D. V. (2020) Prevention of DNA multimerization during isothermal amplification with Bst exo^–DNA polymerase, Biochimie, 168, 259-267, https://doi.org/10.1016/j.biochi.2019.11.013.

16. Сахабутдинова А. Р., Мирсаева Л. Р., Оскорбин И. П., Филипенко М. Л., Гарафутдинов Р. Р. (2020) Устранение мультимеризации ДНК, возникающей при изотермической амплификации в присутствии ДНК полимеразы Bst exo-, Биоорг. Химия, 46, 56-64, https://doi.org/10.31857/S0132342320010091.

17. Garafutdinov, R. R., Gilvanov, A. R., Kupova, O. Y., and Sakhabutdinova, A. R. (2020) Effect of metal ions on isothermal amplification with Bst exo^– DNA polymerase, Int. J. Biol. Macromol., 161, 1447-1455, https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2020.08.028.

18. Schrödinger Suite, Small-Molecule Drug Discovery Suite 2016-4, Schrödinger, LLC, New York, 2016.

19. Garafutdinov, R. R., Kupova, O. Y., and Sakhabutdinova, A. R. (2020) Data on molecular docking simulations of quaternary complexes ‘Bst exo^– polymerase-DNA-dCTP-metal cations’, Data-in-Brief, 33, 106549, https://doi.org/10.1016/j.dib.2020.106549.

20. Protein Preparation Wizard; Epik, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2016; Impact, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2016; Prime, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2016.

21. Sastry, G. M., Adzhigirey, M., Day, T., Annabhimoju, R., and Sherman, W. (2013) Protein and ligand preparation: parameters, protocols, and influence on virtual screening enrichments, J. Comput. Aid. Mol. Des., 27, 221-234, https://doi.org/10.1007/s10822-013-9644-8.

22. Wu, E. Y., and Beese, L. S. (2011) The structure of a high fidelity DNA polymerase bound to a mismatched nucleotide reveals an “ajar” intermediate conformation in the nucleotide selection mechanism, J. Biol. Chem., 286, 19758-19767, https://doi.org/10.1074/jbc.M110.191130.

23. Knorre, D. G., Lavrik, O. I., and Nevinsky, G. A. (1988) Protein-nucleic acid interaction in reactions catalyzed with DNA polymerases, Biochimie, 70, 655-661, https://doi.org/10.1016/0300-9084(88)90250-7.

24. Kolocheva, T. I., Nevinsky, G. A., Levina, A. S., Khomov, V. V., and Lavrik, O. I. (1991) The mechanism of recognition of templates by DNA polymerases from pro- and eukaryotes as revealed by affinity modification data, J. Biomol. Struct. Dyn., 9, 169-186, https://doi.org/10.1080/07391102.1991.10507901.

25. Doronin, S. V., Nevinsky, G. A., Malygina, T. O., Podust, V. N., Khomov, V. V., and Lavrik, O. I. (1989) The efficiency of interaction of deoxyribonucleoside-5’-mono-, di- and triphosphates with the active center of E. coli DNA polymerase I Klenow fragment, FEBS Lett., 259, 83-85, https://doi.org/10.1016/0014-5793(89)81500-5.

26. Kolocheva, T. I., Nevinsky, G. A., Volchkova, V. A., Levina, A. S., Khomov, V. V., and Lavrik, O. I. (1989) DNA polymerase I (Klenow fragment): role of the structure and length of a template in enzyme recognition, FEBS Lett., 248, 97-100, https://doi.org/10.1016/0014-5793(89)80439-9.

27. Garafutdinov, R. R., Burkhanova, G. F., Maksimov, I. V., Sakhabutdinova, A. R. (2023) New method for microRNA detection based on multimerization, Anal. Biochem., 664, 115049, https://doi.org/10.1016/j.ab.2023.115049.

28. Сахабутдинова А. Р., Чемерис А. В., Гарафутдинов Р. Р. (2023) Обнаружение специфических РНК-мишеней с помощью мультимеризации, Биохимия, 88, 832-840, https://doi.org/10.31857/S032097252305010X.