БИОХИМИЯ, 2023, том 88, вып. 10, с. 1908–1925
УДК 577.344;543.421
Фемтосекундная динамика возбужденных состояний тетрамера хлорофилла в водорастворимом хлорофилл-связывающем белке BoWSCP
1 ФИЦ химической физики имени Н.Н. Семенова РАН, 119991 Москва, Россия
2 НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, 119992 Москва, Россия
3 ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН, 119017 Москва, Россия
4 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119992 Москва, Россия
5 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, 119992 Москва, Россия
Поступила в редакцию 22.06.2023
После доработки 22.09.2023
Принята к публикации 22.09.2023
DOI: 10.31857/S0320972523100135
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: хлорофилл a, белки семейства WSCP, фемтосекундная лазерная спектроскопия, спектр возбужденного состояния, экситонная динамика, внутримолекулярная конверсия.
Аннотация
Методом широкополосной фемтосекундной лазерной спектроскопии «возбуждение-зондирование» измерена абсорбционная динамика хлорофилла a в симметричном тетрамерном комплексе водорастворимого хлорофилл-связывающего белка BoWSCP в диапазоне от 400 до 750 нм с временным разрешением 20 фс–200 пс. При возбуждении BoWSCP в области полосы Соре на длине волны 430 нм наблюдалась безызлучательная внутримолекулярная конверсия S3→S1 с характерным временем 83 ± 9 фс. При возбуждении комплекса в области полосы Qy на длине волны 670 нм наблюдался релаксационный переход между двумя экситонными состояниями димера хлорофилла со временем 105 ± 10 фс. Получены спектры поглощения возбужденных синглетных состояний S1 и S3 хлорофилла a. Продемонстрировано, что делокализация возбужденного состояния между экситонно-сопряженными молекулами хлорофилла в тетрамере BoWSCP изменяется во времени и зависит от энергии возбуждения. При возбуждении BoWSCP в области полосы Соре наблюдается сверхбыстрая фотохимическая реакция, обусловленная, по всей видимости, восстановлением триптофана в ближайшем окружении хлорофилла.
Текст статьи
Сноски
* Адресат для корреспонденции.
Финансирование
Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 21‑74‑20155).
Благодарности
Авторы благодарят А.Л. Добрякова за помощь в разработке метода аппроксимации когерентного артефакта и установления аппаратной функции фемтосекундной установки. В работе использовано оборудование (фемтосекундная установка) Центра коллективного пользования ФИЦ ХФ РАН «Анализ химических, биологических систем и природных материалов: масс-спектральная микроскопия и фемтосекундная лазерная микроскопия-спектроскопия» (рег. номер: 506694). Экспрессионный вектор pET‑24b со встроенным геном белка BoWSCP был любезно предоставлен проф. Харальдом Паульсеном (Институт молекулярной физиологии Университета Иоганна Гутенберга, Майнц, Германия).
Вклад авторов
Д.А. Черепанов – анализ результатов спектральных измерений; К.В. Неверов, Ю.Н. Обухов, Ю.В. Малеева – производство, выделение и биохимическая характеристика препаратов BoWSCP; Ф.Е. Гостев, И.В. Шелаев, А.В. Айбуш – разработка математического аппарата, методики и проведение фемтосекундных измерений; М.С. Крицкий, В.А. Надточенко – концепция работы. Все авторы внесли значительный вклад в написание рукописи.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Соблюдение этических норм
Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.
Список литературы
1. Charlton, A., and Zachariou, M. (2007) Immobilized metal ion affinity chromatography of histidine-tagged fusion proteins, Methods Mol. Biol., 421, 137-149, doi: 10.1007/978-1-59745-582-4_10.
2. Cherepanov, D. A., Semenov, A. Y., Mamedov, M. D., Aybush, A. V., Gostev, F. E., Shelaev, I. V., Shuvalov, V. A., and Nadtochenko, V. A. (2022) Current state of the primary charge separation mechanism in photosystem I of cyanobacteria, Biophys. Rev., 14, 805-820, doi: 10.1007/s12551-022-00983-1.
3. Murata, T., Toda, F., Uchino, K., and Yakushiji, E. (1971) Water-soluble chlorophyll protein of Brassica oleracea var. botrys (cauliflower), Biochim. Biophys. Acta Bioenerg., 245, 208-215, doi: 10.1016/0005-2728(71)90023-5.
4. Satoh, H., Nakayama, K., and Okada, M. (1998) Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower, J. Biol. Chem., 273, 30568-30575, doi: 10.1074/jbc.273.46.30568.
5. Takahashi, S., Yanai, H., Nakamaru, Y., Uchida, A., Nakayama, K., and Satoh, H. (2012) Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble chl-binding protein from brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera), Plant Cell Physiol., 53, 879-891, doi: 10.1093/pcp/pcs031.
6. Takahashi, S., Yanai, H., Oka-Takayama, Y., Zanma-Sohtome, A., Fujiyama, K., Uchida, A., Nakayama, K., and Satoh, H. (2013) Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble chlorophyll-binding protein (WSCP) from Virginia pepperweed (Lepidium virginicum), a unique WSCP that preferentially binds chlorophyll b in vitro, Planta, 238, 1065-1080, doi: 10.1007/s00425-013-1952-7.
7. Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., and Okada, M. (2001) Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein, Plant Cell Physiol., 42, 906-911, doi: 10.1093/pcp/pce117.
8. Horigome, D., Satoh, H., Itoh, N., Mitsunaga, K., Oonishi, I., Nakagawa, A., and Uchida, A. (2007) Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein, J. Biol. Chem., 282, 6525-6531, doi: 10.1074/jbc.M609458200.
9. Малеева Ю. В., Неверов К. В., Обухов Ю. Н., Крицкий М. С. (2019) Водорастворимые хлорофиллсвязывающие белки растений: структура, свойства и функции, Мол. Биол., 53, 998-1011, doi: 10.1134/S0026898419060120.
10. Schmitt, F. J., Trostmann, I., Theíss, C., Pieper, J., Renger, T., Fuesers, J., Hubrich, E. H., Paulsen, H., Eichler, H. J., and Renger, G. (2008) Excited state dynamics in recombinant water-soluble chlorophyll proteins (WSCP) from cauliflower investigated by transient fluorescence spectroscopy, J. Phys. Chem. B, 112, 13951-13961, doi: 10.1021/jp8024057.
11. Renger, G., Pieper, J., Theiss, C., Trostmann, I., Paulsen, H., Renger, T., Eichler, H. J., and Schmitt, F. J. (2011) Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: A most suitable model system for basic analyses of pigment–pigment and pigment–protein interactions in chlorophyll protein complexes, J. Plant Physiol., 168, 1462-1472, doi: 10.1016/j.jplph.2010.12.005.
12. Alster, J., Lokstein, H., Dostál, J., Uchida, A., and Zigmantas, D. (2014) 2D spectroscopy study of water-soluble chlorophyll-binding protein from lepidium virginicum, J. Phys. Chem. B, 118, 3524-3531, doi: 10.1021/jp411174t.
13. Fresch, E., Meneghin, E., Agostini, A., Paulsen, H., Carbonera, D., and Collini, E. (2020) How the protein environment can tune the energy, the coupling, and the ultrafast dynamics of interacting chlorophylls: the example of the water-soluble chlorophyll protein, J. Phys. Chem. Lett., 11, 1059-1067, doi: 10.1021/acs.jpclett.9b03628.
14. Theiss, C., Trostmann, I., Andree, S., Schmitt, F. J., Renger, T., Eichler, H. J., Paulsen, H., and Renger, G. (2007) Pigment–pigment and pigment–protein interactions in recombinant water-soluble chlorophyll proteins (WSCP) from cauliflower, J. Phys. Chem. B, 111, 13325-13335, doi: 10.1021/jp0723968.
15. Renger, T., Trostmann, I., Theiss, C., Madjet, M. E., Richter, M., Paulsen, H., Eichler, H. J., Knorr, A., and Renger, G. (2007) Refinement of a structural model of a pigment–protein complex by accurate optical line shape theory and experiments, J. Phys. Chem. B, 111, 10487-10501, doi: 10.1021/jp0717241.
16. Friedl, C., Fedorov, D. G., and Renger, T. (2022) Towards a quantitative description of excitonic couplings in photosynthetic pigment-protein complexes: Quantum chemistry driven multiscale approaches, Phys. Chem. Chem. Phys., 24, 5014-5038, doi: 10.1039/d1cp03566e.
17. Lahav, Y., Noy, D., and Schapiro, I. (2021) Spectral tuning of chlorophylls in proteins – electrostatics vs. ring deformation, Phys. Chem. Chem. Phys., 23, 6544-6551, doi: 10.1039/d0cp06582j.
18. Agostini, A., Meneghin, E., Gewehr, L., Pedron, D., Palm, D. M., Carbonera, D., Paulsen, H., Jaenicke, E., and Collini, E. (2019) How water-mediated hydrogen bonds affect chlorophyll a/b selectivity in water-soluble chlorophyll protein, Sci. Rep., 9, 1-10, doi: 10.1038/s41598-019-54520-54524.
19. Bednarczyk, D., Dym, O., Prabahar, V., Peleg, Y., Pike, D. H., and Noy, D. (2016) Fine tuning of chlorophyll spectra by protein-induced ring deformation, Angew. Chemie Int. Ed., 55, 6901-6905, doi: 10.1002/anie.201512001.
20. Hughes, J. L., Razeghifard, R., Logue, M., Oakley, A., Wydrzynski, T., and Krausz, E. (2006) Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls, J. Am. Chem. Soc., 128, 3649-3658, doi: 10.1021/ja056576b.
21. Обухов Ю. Н., Неверов К. В., Малеева Ю. В., Крицкий М. С. (2023) Димеры хлорофилла a в составе водорастворимого белка BoWSCP фотосенсибилизируют восстановление цитохрома c, Докл. Акад. Наук, 509, 191-195, doi: 10.31857/S2686738922600790.
22. Takahashi, S., Uchida, A., Nakayama, K., and Satoh, H. (2014) Three-step photoconversion of only three subunits of the water-soluble chlorophyll-binding protein tetramer from Chenopodium album, Protein J., 33, 337-343, doi: 10.1007/s10930-014-9565-y.
23. Kelly, S. M., Jess, T. J., and Price, N. C. (2005) How to study proteins by circular dichroism, Biochim. Biophys. Acta Proteins Proteomics, 1751, 119-139, doi: 10.1016/j.bbapap.2005.06.005.
24. Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 72, 248-254, doi: 10.1016/0003-2697(76)90527-3.
25. Cherepanov, D. A., Shelaev, I. V., Gostev, F. E., Mamedov, M. D., Petrova, A. A., Aybush, A. V., Shuvalov, V. A., Semenov, A. Y., and Nadtochenko, V. A. (2017) Mechanism of adiabatic primary electron transfer in photosystem I: Femtosecond spectroscopy upon excitation of reaction center in the far-red edge of the Q Y band, Biochim. Biophys. Acta Bioenerg., 1858, 895-905, doi: 10.1016/j.bbabio.2017.08.008.
26. Dobryakov, A. L., Pérez Lustres, J. L., Kovalenko, S. A., and Ernsting, N. P. (2008) Femtosecond transient absorption with chirped pump and supercontinuum probe: Perturbative calculation of transient spectra with general lineshape functions, and simplifications, Chem. Phys., 347, 127-138, doi: 10.1016/j.chemphys.2007.11.003.
27. Golubeva, E. N., Zubanova, E. M., Melnikov, M. Y., Gostev, F. E., Shelaev, I. V., and Nadtochenko, V. A. (2014) Femtosecond spectroscopy and TD-DFT calculations of CuCl42− excited states, Dalt. Trans., 43, 17820-17827, doi: 10.1039/C4DT01409J.
28. Dobryakov, A. L., Kovalenko, S. A., Weigel, A., Ṕrez-Lustres, J. L., Lange, J., Müller, A., and Ernsting, N. P. (2010) Femtosecond pump/supercontinuum-probe spectroscopy: Optimized setup and signal analysis for single-shot spectral referencing, Rev. Sci. Instrum., 81, 113106, doi: 10.1063/1.3492897.
29. Kovalenko, S. A., Dobryakov, A. L., Ruthmann, J., and Ernsting, N. P. (1999) Femtosecond spectroscopy of condensed phases with chirped supercontinuum probing, Phys. Rev. A At. Mol. Opt. Phys., 59, 2369-2384, doi: 10.1103/PhysRevA.59.2369.
30. Šimůnek, J., and Hopmans, J. W. (2002) 1.7 parameter optimization and nonlinear fitting, Methods Soil Anal. Part 4 Phys. Methods, 5, 139-157, doi: 10.2136/sssabookser5.4.c7.
31. Clementson, L. A., and Wojtasiewicz, B. (2019) Dataset on the absorption characteristics of extracted phytoplankton pigments, Data Br., 24, 103875, doi: 10.1016/j.dib.2019.103875.
32. Sirohiwal, A., Berraud-Pache, R., Neese, F., Izsák, R., and Pantazis, D. A. (2020) Accurate computation of the absorption spectrum of chlorophyll a with pair natural orbital coupled cluster methods, J. Phys. Chem. B, 124, 8761-8771, doi: 10.1021/acs.jpcb.0c05761.
33. Gouterman, M. (1961) Spectra of porphyrins, J. Mol. Spectrosc., 6, 138-163, doi: 10.1016/0022-2852(61)90236-3.
34. Bricker, W. P., Shenai, P. M., Ghosh, A., Liu, Z., Enriquez, M. G. M., Lambrev, P. H., Tan, H. S., Lo, C. S., Tretiak, S., Fernandez-Alberti, S., and Zhao, Y. (2015) Non-radiative relaxation of photoexcited chlorophylls: theoretical and experimental study, Sci. Rep., 5, 1-16, doi: 10.1038/srep13625.
35. Götze, J. P., Anders, F., Petry, S., Witte, J. F., and Lokstein, H. (2022) Spectral characterization of the main pigments in the plant photosynthetic apparatus by theory and experiment, Chem. Phys., 559, 111517, doi: 10.1016/j.chemphys.2022.111517.
36. Umetsu, M., Wang, Z. Y., Kobayashi, M., and Nozawa, T. (1999) Interaction of photosynthetic pigments with various organic solvents. Magnetic circular dichroism approach and application to chlorosomes, Biochim. Biophys. Acta Bioenerg., 1410, 19-31, doi: 10.1016/S0005-2728(98)00170-4.
37. Shipman, L. L., Cotton, T. M., Norris, J. R., and Katz, J. J. (1976) An analysis of the visible absorption spectrum of chlorophyll a monomer, dimer,and oligomers in solution, J. Am. Chem. Soc., 98, 8222-8230, doi: 10.1021/ja00441a056.
38. Черепанов Д. А., Милановский Г. Е., Айбуш А. В., Надточенко В. А. (2023) Дипольный момент перехода S0→S1 хлорофилла a в растворителях с различным индексом рефракции, Хим. Физ., 42, 77-78, doi: 10.31857/S0207401X23060031.
39. Berera, R., Van Grondelle, R., and Kennis, J. T. M. (2009) Ultrafast transient absorption spectroscopy: principles and application to photosynthetic systems, Photosynth. Res., 101, 105-118, doi: 10.1007/s11120-009-9454-y.
40. Черепанов Д. А., Гостев Ф. Е., Шелаев И. В., Айбуш А. В., Семенов А. Ю., Мамедов М. Д., Шувалов В. А., Надточенко В. А. (2020) Абсорбционный спектр возбужденного синглетного состояния хлорофилла a в видимом и ближнем инфракрасном диапазонах, Хим. Выс. Энерг., 54, 158-160, doi: 10.31857/S0023119320020059.
41. Cherepanov, D. A., Petrova, A. A., Mamedov, M. D., Vishnevskaya, A. I., Gostev, F. E., Shelaev, I. V., Aybush, A. V., and Nadtochenko, V. A. (2022) Comparative absorption dynamics of the singlet excited states of chlorophylls a and d, Biochem., 87, 1179-1186, doi: 10.1134/S000629792210011X.
42. Davydov, A. S. (1962) The Theory Of Molecular Excitons, McGraw-Hill, New York, NY.
43. Kasha, M., Rawls, H. R., and El-Bayoumi, M. A. (1965) The exciton model in molecular spectroscopy, Pure Appl. Chem., 11, 371-392, doi: 10.1351/pac196511030371.
44. Scholes, G. D., and Ghiggino, K. P. (1994) Rate expressions for excitation transfer I. Radiationless transition theory perspective, J. Chem. Phys., 101, 1251-1261, doi: 10.1063/1.467817.
45. Renger, T., and Marcus, R. A. (2002) On the relation of protein dynamics and exciton relaxation in pigment-protein complexes: an estimation of the spectral density and a theory for the calculation of optical spectra, J. Chem. Phys., 116, 9997-10019, doi: 10.1063/1.1470200.
46. Pieper, J., Rätsep, M., Trostmann, I., Schmitt, F. J., Theiss, C., Paulsen, H., Eichler, H. J., Freiberg, A., and Renger, G. (2011) Excitonic energy level structure and pigment-protein interactions in the recombinant water-soluble chlorophyll protein. II. Spectral hole-burning experiments, J. Phys. Chem. B, 115, 4053-4065, doi: 10.1021/jp111457t.
47. Kell, A., Bednarczyk, D., Acharya, K., Chen, J., Noy, D., and Jankowiak, R. (2016) New insight into the water-soluble chlorophyll-binding protein from Lepidium virginicum, Photochem. Photobiol., 92, 428-435, doi: 10.1111/php.12581.
48. Adolphs, J., Berrer, M., and Renger, T. (2016) Hole-burning spectroscopy on excitonically coupled pigments in proteins: theory meets experiment, J. Am. Chem. Soc., 138, 2993-3001, doi: 10.1021/jacs.5b08246.
49. Gillie, J. K., Lyle, P. A., Small, G. J., and Golbeck, J. H. (1989) Spectral hole burning of the primary electron donor state of Photosystem I, Photosynth. Res., 22, 233-246, doi: 10.1007/BF00048302.
50. Pieper, J., Voigt, J., and Small, G. J. (1999) Chlorophyll a Franck–Condon factors and excitation energy transfer, J. Phys. Chem. B, 103, 2321-2322, doi: 10.1021/jp984460e.
51. Peternian, E. J. G., Pullerits, T., van Grondelle, R., and van Amerongen, H. (1997) Electron-phonon coupling and vibronic fine structure of light-harvesting complex II of green plants: temperature dependent absorption and high-resolution fluorescence spectroscopy, J. Phys. Chem. B, 101, 4448-4457, doi: 10.1021/jp962338e.
52. Förster, T. (1948) Intermolecular energy migration and fluorescence [in German], Ann. Phys., 437, 55-75, doi: 10.1002/andp.19484370105.
53. Cherepanov, D. A., Shelaev, I. V., Gostev, F. E., Aybush, A. V., Mamedov, M. D., Shuvalov, V. A., Semenov, A. Y., and Nadtochenko, V. A. (2020) Generation of ion-radical chlorophyll states in the light-harvesting antenna and the reaction center of cyanobacterial photosystem I, Photosynth. Res., 146, 55-73, doi: 10.1007/s11120-020-00731-0.
54. Cherepanov, D. A., Shelaev, I. V., Gostev, F. E., Aybush, A. V., Mamedov, M. D., Shen, G., Nadtochenko, V. A., Bryant, D. A., Semenov, A. Y., and Golbeck, J. H. (2020) Evidence that chlorophyll f functions solely as an antenna pigment in far-red-light photosystem I from Fischerella thermalis PCC 7521, Biochim. Biophys. Acta Bioenerg., 1861 doi: 10.1016/j.bbabio.2020.148184.
55. Shelaev, I. V., Gostev, F. E., Mamedov, M. D., Sarkisov, O. M., Nadtochenko, V. A., Shuvalov, V. A., and Semenov, A. Y. (2010) Femtosecond primary charge separation in Synechocystis sp. PCC 6803 photosystem I, Biochim. Biophys. Acta Bioenerg., 1797, 1410-1420, doi: 10.1016/j.bbabio.2010.02.026.
56. Van Stokkum, I. H. M., Müller, M. G., Weißenborn, J., Weigand, S., Snellenburg, J. J., and Holzwarth, A. R. (2023) Energy transfer and trapping in photosystem I with and without chlorophyll-f, IScience, 26, 107650, doi: 10.1016/J.ISCI.2023.107650.
57. Pålsson, L.-O. O., Flemming, C., Gobets, B., van Grondelle, R., Dekker, J. P., and Schlodder, E. (1998) Energy transfer and charge separation in photosystem I: P700 oxidation upon selective excitation of the long-wavelength antenna chlorophylls of Synechococcus elongatus, Biophys. J., 74, 2611-2622, doi: 10.1016/S0006-3495(98)77967-6.
58. Gobets, B., Kennis, J. T. M., Ihalainen, J. A., Brazzoli, M., Croce, R., Stokkum, I. H. M. van, Bassi, R., Dekker, J. P., van Amerongen, H., Fleming, G. R., and van Grondelle, R. (2001) Excitation energy transfer in dimeric light harvesting complex I: a combined streak-camera/fluorescence upconversion study, J. Phys. Chem. B, 105, 10132-10139, doi: 10.1021/jp011901c.
59. Riley, K. J., Reinot, T., Jankowiak, R., Fromme, P., and Zazubovich, V. (2007) Red antenna states of photosystem I from cyanobacteria Synechocystis PCC 6803 and Thermosynechococcus elongatus: single-complex spectroscopy and spectral hole-burning study, J. Phys. Chem. B, 111, 286-292, doi: 10.1021/jp062664m.
60. Gisriel, C., Shen, G., Kurashov, V., Ho, M. Y., Zhang, S., Williams, D., Golbeck, J. H., Fromme, P., and Bryant, D. A. (2020) The structure of Photosystem I acclimated to far-red light illuminates an ecologically important acclimation process in photosynthesis, Sci. Adv., 6, eaay6415, doi: 10.1126/sciadv.aay6415.
61. Young, R. M., and Wasielewski, M. R. (2020) Mixed electronic states in molecular dimers: Connecting singlet fission, excimer formation, and symmetry-breaking charge transfer, Acc. Chem. Res., 53, 1957-1968, doi: 10.1021/acs.accounts.0c00397.
62. Casanova, D. (2018) Theoretical modeling of singlet fission, Chem. Rev., 118, 7164-7207, doi: 10.1021/acs.chemrev.7b00601.
63. Petrova, A. A., Casazza, A. P., Shelaev, I. V., Gostev, F. E., Aybush, A. V., Nadtochenko, V. A., Semenov, A. Y., Santabarbara, S., and Cherepanov, D. A. (2023) Role of pheophytin a in the primary charge separation of photosystem I from Acaryochloris marina: femtosecond optical studies of excitation energy and electron transfer reactions, Biochim. Biophys. Acta Bioenerg., 1864, 148984, doi: 10.1016/j.bbabio.2023.148984.
64. Akhtar, P., and Lambrev, P. H. (2020) On the spectral properties and excitation dynamics of long-wavelength chlorophylls in higher-plant photosystem I, Biochim. Biophys. Acta Bioenerg., 1861, 148274, doi: 10.1016/J.BBABIO.2020.148274.
65. Karapetyan, N. V., Bolychevtseva, Y. V., Yurina, N. P., Terekhova, I. V., Shubin, V. V., and Brecht, M. (2014) Long-wavelength chlorophylls in photosystem I of cyanobacteria: origin, localization, and functions, Biochemistry (Moscow), 79, 213-220, doi: 10.1134/S0006297914030067.