БИОХИМИЯ, 2023, том 88, вып. 9, с. 1667–1680
УДК 577.12
NAD+‑Зависимая формиатдегидрогеназа из термотолерантных дрожжей Ogataea parapolymorpha: свойства и белковая инженерия N‑концевой последовательности
1 Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Институт биохимии имени А.Н. Баха, 119071 Москва, Россия
2 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991 Москва, Россия
3 ФГАОУ ВО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), 119991 Москва, Россия
Поступила в редакцию 12.06.2023
После доработки 07.07.2023
Принята к публикации 12.07.2023
DOI: 10.31857/S0320972523090178
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: формиатдегидрогеназа, Ogataea parapolymorpha DL‑1, термотолерантные дрожжи, экспрессия в E. coli, каталитические свойства, очистка, температурная стабильность, сайт-направленный мутагенез.
Аннотация
Ранее в нашей лаборатории был клонирован ген формиатдегидрогеназы (ФДГ, КФ 1.2.1.2) из термотолерантных метилотрофных дрожжей Ogataea parapolymorpha DL‑1 (OpaFDH). Рекомбинантный фермент с дополнительным аминокислотным остатком глицина (OpaFDH_GK) был получен в клетках Escherichia coli в активной и растворимой форме с выходом более 1 г с одного литра среды. В настоящей работе проведено подробное сравнение этого фермента с ФДГ из других источников. Среди формиатдегидрогеназ из эукариот OpaFDH имеет самую высокую термостабильность. Для выяснения влияния N‑концевого остатка на свойства фермента также были получены варианты OpaFDH_K (идентичный природному) и OpaFDH_AK, содержащий на N‑конце дополнительный остаток аланина. Показано, что добавление к N‑концу остатка Ala уменьшает в 4 раза константу скорости термоинактивации по сравнению с добавлением остатка Gly. Добавление еще 6 остатков гистидина на N‑конец OpaFDH_AK приводит к ускорению очистки, практически не влияет на кинетические параметры, но несколько снижает температурную стабильность, которая, однако, может быть восстановлена до уровня OpaFDH_AK добавлением 0,5 М NaCl.
Текст статьи
Сноски
* Адресат для корреспонденции.
Финансирование
Работа выполнена частично в рамках государственного научного задания.
Вклад авторов
А.А.П., В.И.Т. – концепция и руководство работой; С.А.З., Р.П.К., Л.А.Ш., Д.Л.А., Е.В.П., С.С.С. – проведение экспериментов; А.А.П., Л.А.Ш., В.И.Т. – обсуждение результатов исследования; А.А.П. и Л.А.Ш. – написание текста; А.А.П., С.С.С., В.И.Т. – редактирование текста статьи.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Соблюдение этических норм
Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.
Список литературы
1. Tishkov, V. I., and Popov, V. O. (2004) Catalytic mechanism and application of formate dehydrogenase, Biochemistry (Moscow), 69, 1252-1267, doi: 10.1007/s105410050071x.
2. Tishkov, V. I., and Popov, V. O. (2006) Protein engineering of formate dehydrogenase, Biomol. Eng., 23, 89-110, doi: 10.1016/j.bioeng.2006.02.003.
3. Alekseeva, A. A., Savin, S. S., and Tishkov, V. I (2011) NAD+-dependent formate dehydrogenase from plants, Acta Naturae, 3, 38-54, doi: 10.32607/20758251-2011-3-4-38-54.
4. Tishkov, V. I., Pometun, A. A., and Savin, S. S. (2023) Formate dehydrogenase: from NAD(P)H regeneration to targeting pathogen biofilms, composing highly efficient hybrid biocatalysts and atmospheric CO2 fixation, Moscow Univ. Chem. Bull., 78, 151-169, doi: 10.3103/S0027131423040077.
5. Kragl, U., Kruse, W., Hummel, W., and Wandrey, C. (1996) Enzyme engineering aspects of biocatalysis: cofactor regeneration as example, Biotechnol. Bioeng., 52, 309-319, doi: 10.1002/(SICI)1097-0290.
6. Tishkov, V. I., Galkin, A. G., Marchenko, G. N., Tsygankov, Y. D., and Egorov, A. M. (1993) Formate dehydrogenase from methylotrophic bacterium Pseudomonas sp. 101: gene cloning and expression in Escherichia coli, Biotechnol. Appl. Biochem., 18, 201-207.
7. Yu, S., Zhu, L., Zhou, C., An, T., Zhang, T., Jiang, B., and Mu, W. (2014) Promising properties of a formate dehydrogenase from a methanol-assimilating yeast Ogataea parapolymorpha DL-1 in His-tagged form, Appl. Microbiol. Biotechnol., 98, 1621-1630, doi: 10.1007/s00253-013-4996-5.
8. Tishkov, V. I., Pometun, A. A., Stepashkina, A. V., Fedorchuk, V. V., Zarubina, S. A., Kargov, I. S., Atroshenko, D. L., Parshin, P. D., Kovalevski, R. P., Boiko, K. M., Eldarov, M. A., D’Oronzo, E., Facheris, S., Secundo, F., and Savin, S. S. (2018) Rational design of practically important enzymes, Moscow Univ. Chem. Bull., 73, 1-6, doi: 10.3103/S0027131418020153.
9. Pometun, A. A., Kleymenov, S. Y., Zarubina, S. A., Kargov, I. S., Parshin, P. D., Sadykhov, E. G., Savin, S. S., and Tishkov, V. I. (2018) Comparison of thermal Stability of new formate dehydrogenases by differential scanning calorimetry, Moscow Univ. Chem. Bull., 73, 80-84, doi: 10.3103/S002713141802013X.
10. Pometun, A. A., Boyko, K. M., Zubanova, S. A., Nikolaeva, A. Yu., Atroshenko, D. L., Savin, S. S., and Tishkov, V. I. (2021) Preparation of recombinant formate dehydrogenase from thermotolerant yeast Ogataea parapolymorpha and crystallization of its apo- and holo-forms, Moscow Univ. Chem. Bull., 76, 49-55, doi: 10.3103/S0027131421010120.
11. Rojkova, A. M., Galkin, A. G., Kulakova, L. B., Serov, A. E., Savitsky, P. A., Fedorchuk, V. V., and Tishkov, V. I. (1999) Bacterial formate dehydrogenase. Increasing the enzyme thermal stability by hydrophobization of alpha-helices, FEBS Lett., 445, 183-188, doi: 10.1016/S0014-5793(99)00127-1.
12. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. (1991) Справочник биохимика, Мир, Москва, ISBN 5-03-001032-7.
13. Varshavsky, A. (2011) The N-end rule pathway and regulation by proteolysis, Protein Sci., 20, 1298-1345, doi: 10.1002/pro.666.
14. Klyushnichenko, V., Tishkov, V., and Kula, M.-R. (1997) Rapid SDS-gel capillary electrophoresis for the analysis of recombinant NADP+-dependent formate dehydrogenase during expression in E. coli cells and purification, J. Biotechnol., 58, 187-195, doi: 10.1016/S0168-1656(97)00149-1.
15. Pometun, A. A., Parshin, P. D., Galanicheva, N. P., Uporov, I. V., Atroshenko, D. L., Savin, S. S., and Tishkov, V. I. (2020) Influence of His6 sequence on the properties of formate dehydrogenase from bacterium Pseudomonas sp. 101, Moscow Univ. Chem. Bull., 75, 250-257, doi: 10.3103/S0027131420040057.
16. Shaposhnikov, L. A., Savin, S. S., Atroshenko, D. L., Chubar, T. A., Pometun, E. V., Tishkov, V. I., and Pometun, A. A. (2023) Engineering the N-terminal sequence of Glycine max soybean formate dehydrogenase, Moscow Univ. Chem. Bull., 78, 220-230, doi: 10.3103/S0027131423040053.
17. Hatrongjit, R., and Packdibamrung, K. (2010) A novel NADP–-dependent formate dehydrogenase from Burkholderia stabilis 15516: Screening, purification and characterization, Enzyme Microb. Technol., 46, 557-561, doi: 10.1016/j.enzmictec.2010.03.002.
18. Ding, H. T., Liu, D. F., Li, Z. L., Du, Y. Q., Xu, X. H., and Zhao, Y. H. (2011) Characterization of a thermally stable and organic solvent-adaptative NAD+-dependent formate dehydrogenase from Bacillus sp. F1, J. Appl. Microbiol., 111, 1075-1085, doi: 10.1111/j.1365-2672.2011.05124.x.
19. Andreadeli, A., Flemetakis, E., Axarli, I., Dimou, M., Udvardi, M. K., Katinakis, P., and Labrou, N. E. (2009) Cloning and characterization of Lotus japonicus formate dehydrogenase: a possible correlation with hypoxia, Biochim. Biophys. Acta, 1794, 976-984, doi: 10.1016/j.bbapap.2009.02.009.
20. Pometun, A. A., Voinova, N. S., Pometun, E. V., Savin, S. S., and Tishkov, V. I. (2018) Effect of medium pH and ion strength on the thermal stability of plant formate dehydrogenases, Moscow Univ. Chem. Bull., 73, 199-203, doi: 10.3103/S0027131418040077.
21. Cornish-Bowden, A. (2012) in Fundamentals of Enzyme Kinetic 4th Ed., Wiley-Blackwell, Singapore, p. 18-20.
22. Tishkov, V. I., Goncharenko, K. V., Alekseeva, A. A., Kleymenov, S. Yu, and Savin, S. S. (2015) Role of a structurally equivalent phenylalanine residue in catalysis and thermal stability of formate dehydrogenases from different sources, Biochemistry (Moscow), 80, 1690-1700, doi: 10.1134/S0006297915130052.