БИОХИМИЯ, 2023, том 88, вып. 9, с. 1556–1569

УДК 577.1

Анализ некоторых биохимических свойств рекомбинантного химозина сибирской косули (Capreolus pygargus), полученного в культуре клеток млекопитающих (CHO‑K1)

© 2023 Д.Е. Мурашкин 1, С.В. Беленькая 1,2*belenkaya.sveta@gmail.com, А.А. Бондарь 3, В.В. Ельчанинов 4, Д.Н. Щербаков 1,5

1 Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, 630559 Кольцово, Новосибирская обл., Россия

2 Новосибирский государственный университет, 630090 Новосибирск, Россия

3 ЦКП «Геномика», Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090 Новосибирск, Россия

4 Федеральный Алтайский научный центр агробиотехнологий, Сибирский НИИ сыроделия, 656910 Барнаул, Россия

5 Алтайский государственный университет, 656049 Барнаул, Россия

Поступила в редакцию 16.05.2023
После доработки 13.07.2023
Принята к публикации 15.07.2023

DOI: 10.31857/S0320972523090087

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: система экспрессии млекопитающих, СНО‑К1, рекомбинантный химозин, сибирская косуля, молокосвёртывающая активность, протеолитическая активность, термостабильность.

Аннотация

Впервые установлена структура гена химозина (Хн) сибирской косули (Capreolus pygargus) и определена его экзон/интронная организация. Методом Golden Gate реконструирована и получена в виде ДНК-клона кодирующая часть гена Хн C. pygargus. Сравнительный анализ последовательностей прохимозинов (ПроХн) косули, коровы и одногорбого верблюда выявил ряд аминокислотных замен на участках, формирующих субстрат-связывающую полость фермента и затрагивающих субсайты специфичности S4 и S1′ + S3′. С использованием интеграционного вектора pIP1 сконструирована рекомбинантная плазмида pIP1‑Cap для экспрессии гена ПроХн косули в клетках CHO‑K1. Получен поликлон клеток CHO‑K1‑CYM‑Cap, обеспечивающий синтез и секрецию рекомбинантного ПроХн в культуральную жидкость. В результате активации зимогена получен препарат рекомбинантного Хн косули с общей молокосвёртывающей активностью 468,4 ± 11,1 IMCU/мл (IMCU – International Milk Clotting Units, международные единицы молокосвертывающей активности). Выход рекомбинантного Хн косули составил 500 мг/л или ≈ 468 000 IMCU/л, что превышает показатели выхода генно-инженерных Хн в большинстве используемых систем экспрессии. Основные биохимические свойства полученного фермента сравнивали с коммерческими препаратами рекомбинантных Хн одногорбого верблюда (Camelus dromedarius) и коровы (Bos taurus). Удельная молоко-свёртывающая активность рекомбинантного Хн C. pygargus составила 938 ± 22 IMCU/мг белка и была сопоставима с показателями ферментов сравнения. Неспецифическая протеолитическая активность рекомбинантного Хн косули оказалась в 1,4–4,5 раза выше, чем у ферментов коровы и верблюда. По коагуляционной специфичности рекомбинантный Хн C. pygargus занимал промежуточное положение между генно-инженерными аналогами Хн B. taurus и C. dromedarius. Порог термостабильности рекомбинантного Хн косули был равен 55 °С. При 60 °С фермент сохранял < 1% от исходной молокосвёртывающей активности, а его полная термоинактивация наблюдалась при 65 °С.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи:

captcha

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Вклад авторов

Д.Е. Мурашкин и С.В. Беленькая написали рукопись; А.А. Бондарь подготовил иллюстрации; В.В. Ельчанинов и Д.Н. Щербаков отредактировали текст статьи.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение от 12.10.2021 № 075‑15‑2021‑1355) в рамках реализации отдельных мероприятий Федеральной научно-технической программы развития синхротронных и нейтронных исследований и исследовательской инфраструктуры на 2019–2027 гг.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания выполненных авторами исследований с участием людей или использованием животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Gilliland, G. L., Winborne, E. L., Nachman, J., and Wlodawer, A. (1990) The three-dimensional structure of recombinant bovine chymosin at 2.3 Å resolution, Proteins, 8, 82-101, doi: 10.1002/prot.340080110.

2. Khan, A. R., Khazanovich-Bernstein, N., Bergmann, E. M., and James, M. N. (1999) Structural aspects of activation pathways of aspartic protease zymogens and viral 3C protease precursors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 10968-10975, doi: 10.1073/pnas.96.20.10968.

3. Richter, C., Tanaka, T., and Yada, R. Y. (1998) Mechanism of activation of the gastric aspartic proteinases: pepsinogen, progastricsin and prochymosin, Biochem. J., 335, 481-490, doi: 10.1042/bj3350481.

4. Chen, H., Zhang, G., Zhang, Y., Dong, Y., and Yang, K. (2000) Functional implications of disulfide bond, Cys206–Cys210, in recombinant prochymosin (chymosin), Biochemistry, 39, 12140-12148, doi: 10.1021/bi000976o.

5. Eskandari, M. H., Hosseini, A., Alasvand Zarasvand, S., and Aminlari, M. (2012) Cloning, expression, purification and refolding of caprine prochymosin, Food Biotechnol., 26, 143-153, doi: 10.1080/08905436.2012.670829.

6. Belenkaya, S. V., Rudometov, A. P., Shcherbakov, D. N., Balabova, D. V., Kriger, A. V., et al. (2018) Biochemical properties of recombinant chymosin in alpaca (Vicugna pacos L.), Appl. Biochem. Microbiol., 54, 569-576, doi: 10.1134/S0003683818060054.

7. Balabova, D. V., Rudometov, A. P., Belenkaya, S. V., Belov, A. N., Koval, A. D., et al. (2022) Biochemical and technological properties of moose (Alces alces) recombinant chymosin, Vavilov J. Genet. Breeding, 26, 240-247, doi: 10.18699/VJGB-22-31.

8. Parente, D., de Ferra, F., Galli, G., and Grandi, G. (1991) Prochymosin expression in Bacillus subtilis, FEMS Microbiol. Lett., 77, 243-249, doi: 10.1111/j.1574-6968.1991.tb04356.x.

9. Liu, W. G., Wang, Y. P., Zhang, Z. J., Wang, M., Lv, Q. X., et al. (2017) Generation and characterization of caprine chymosin in corn seed, Protein Express. Purif., 135, 78-82, doi: 10.1016/j.pep.2017.05.004.

10. Wei, Z. Y., Zhang, Y. Y., Wang, Y. P., Fan, M. X., Zhong, X. F., et al. (2016) Production of bioactive recombinant bovine chymosin in tobacco plants, Int. J. Mol. Sci., 17, 624, doi: 10.3390/ijms17050624.

11. Azizi-Dargahlou, S., Ahmadabadi, M., and Valizadeh Kamran, R. (2022) Biolistic transformation and expression of functional chymosin from a codon-optimized synthetic bovine gene in tobacco plants, J. Med. Plants By-Product, doi: 10.22092/jmpb.2022.356717.1425.

12. Rozov, S. M., Permyakova, N. V., and Deineko, E. V. (2018) Main strategies of plant expression system glycoengineering for producing humanized recombinant pharmaceutical proteins, Biochemistry (Moscow), 83, 215-232, doi: 10.1134/S0006297918030033.

13. Kappeler, S. R., Rahbek-Nielsen, H., Farah, Z., Puhan, Z., Hansen, E. B., and Johansen, E. (2006) Characterization of recombinant camel chymosin reveals superior properties for the coagulation of bovine and camel milk, Biochem. Biophys. Res. Commun., 342, 647-654, doi: 10.1016/j.bbrc.2006.02.014.

14. Vallejo, J. A., Ageitos, J. M., Poza, M., and Villa, T. G. (2008) Cloning and expression of buffalo active chymosin in Pichia pastoris, J. Agricult. Food Chem., 56, 10606-10610, doi: 10.1021/jf802339e.

15. Espinoza-Molina, J. A., Acosta-Muñiz, C. H., Sepulveda, D. R., Zamudio-Flores, P. B., and Rios-Velasco, C. (2016) Codon optimization of the “Bos Taurus Chymosin” gene for the production of recombinant chymosin in Pichia pastoris, Mol. Biotechnol., 58, 657-664, doi: 10.1007/s12033-016-9965-7.

16. Kappeler, S., Farah, Z., van den Brink, J. M., Rahbek-Nielsen, H., and Budtz, P. (2016) U.S. Patent No. 9,307,775, Washington, DC, U.S. Patent and Trademark Office.

17. Беленькая С. В., Ельчанинов В. В., Щербаков Д. Н. (2021) Разработка продуцента рекомбинантного химозина марала на основе дрожжей Kluyveromyces lactis, Биотехнология, 37, 20-27, doi: 10.21519/0234-2758-2021-37-5-20-27.

18. Uniacke-Lowe, T., and Fox, P. F. (2017) Chymosin, pepsins and other aspartyl proteinases: Structures, functions, catalytic mechanism and milk-clotting properties, in Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology, Elsevier, Academic Press, pp. 69-113, doi: 10.1016/B978-0-12-417012-4.00004-1.

19. Gottlieb, T. A., Beaudry, G., Rizzolo, L., Colman, A., Rindler, M., et al. (1986) Secretion of endogenous and exogenous proteins from polarized MDCK cell monolayers, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2100-2104, doi: 10.1073/pnas.83.7.2100.

20. Kolmer, M., Örd, T., and Ulmanen, I. (1991) Expression of recombinant calf prochymosin in mammalian cell culture, J. Biotechnol., 20, 131-139, doi: 10.1016/0168-1656(91)90222-H.

21. McKenzie, E. A., and Abbott, W. M. (2018) Expression of recombinant proteins in insect and mammalian cells, Methods, 147, 40-49, doi: 10.1016/j.ymeth.2018.05.013.

22. Zhu, J. (2012) Mammalian cell protein expression for biopharmaceutical production, Biotechnol. Adv., 30, 1158-1170, doi: 10.1016/j.biotechadv.2011.08.022.

23. Kunert, R., and Reinhart, D. (2016) Advances in recombinant antibody manufacturing, Appl. Microbiol. Biotechnol., 100, 3451-3461, doi:10.1007/s00253-016-7388-9.

24. Tihanyi, B., and Nyitray, L. (2020) Recent advances in CHO cell line development for recombinant protein production, Drug Discov. Today Technol., 38, 25-34, doi: 10.1016/j.ddtec.2021.02.003.

25. Belenkaya, S. V., Shcherbakov, D. N., Balabova, D. V., Belov, A. N., Koval, A. D., and Elchaninov, V. V. (2020) Production of maral (Cervus elaphus sibiricus Severtzov) recombinant chymosin in the prokaryotic expression system and the study of the aggregate of its biochemical properties relevant for the cheese-making industry, Appl. Biochem. Microbiol., 56, 647-656, doi: 10.1134/S0003683820060034.

26. Belenkaya, S. V., Bondar, A. A., Kurgina, T. A., Elchaninov, V. V., Bakulina, A. Y., Rukhlova, E. A., Lavrik, O. I., Ilyichev, A. A., and Shcherbakov, D. N. (2020) Characterization of the Altai maral chymosin gene, production of a chymosin recombinant analog in the prokaryotic expression system, and analysis of its several biochemical properties, Biochemistry (Moscow), 85, 781-791, doi: 10.1134/S0006297920070068.

27. Белов А. Н., Коваль А. Д., Пушкарев В. А., Миронова А. В., Щербаков Д. Н., и др. (2022) Первый опыт применения отечественного рекомбинантного химозина при выработке сыра с низкой температурой второго нагревания, Сыроделие и маслоделие, 3, 28-32, doi: 10.31515/2073-4018-2022-3-28-32.

28. Engler, C., Kandzia, R., and Marillonnet, S. (2008) A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability, PLoS One, 3, e3647, doi: 10.1371/journal.pone.0003647.

29. Derouazi, M., Girard, P., Van Tilborgh, F., Iglesias, K., Muller, N., et al. (2004) Serum-free large-scale transient transfection of CHO cells, Biotechnol. Bioeng., 87, 537-545, doi: 10.1002/bit.20161.

30. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685, doi: 10.1038/227680a0.

31. Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 72, 248-254, doi: 10.1016/0003-2697(76)90527-3.

32. Reinhart, D., Damjanovic, L., Kaisermayer, C., Sommeregger, W., Gili, A., et al. (2019) Bioprocessing of recombinant CHO-K1, CHO-DG44, and CHO-S: CHO expression hosts favor either mAb production or biomass synthesis, Biotechnol. J., 14, 1700686, doi: 10.1002/biot.201700686.

33. Akishev, Z., Abdullayeva, A., Mussakhmetov, A., Bekbayeva, A., Tursunbekova, A., et al. (2023) The obtaining of the recombinant camel chymosin by submerge fermentation in the pilot bioreactor, Eur. J. Appl. Biotechnol., 1, 45-55, doi: 10.11134/btp.1.2023.4.

34. Ersöz, F., and İnan, M. (2019) Large-scale production of yak (Bos grunniens) chymosin A in Pichia pastoris, Protein Express. Purif., 154, 126-133, doi: 10.1016/j.pep.2018.10.007.

35. Wang, N., Wang, K. Y., Li, G., Guo, W., and Liu, D. (2015) Expression and characterization of camel chymosin in Pichia pastoris, Protein Express. Purif., 111, 75-81, doi: 10.1016/j.pep.2015.03.012.

36. Bodie, E. A., Armstrong, G. L., Dunn-Coleman, N. S. (1994) Strain improvement of chymosin-producing strains of Aspergillus niger var. awamori using parasexual recombination, Enzyme Microb. Technol., 16, 376-382, doi:10.1016/0141-0229(94)90151-1.

37. Van den Brink, H. J. M., Petersen, S. G., Rahbek-Nielsen, H., Hellmuth, K., and Harboe, M. (2006) Increased production of chymosin by glycosylation, J. Biotechnol., 125, 304-310, doi: 10.1016/j.jbiotec.2006.02.024.

38. Horne, D. S. (2002) Casein structure, self-assembly and gelation, Curr. Opin. Colloid Interf. Sci., 7, 456-461, doi: 10.1016/S1359-0294(02)00082-1.

39. Holt, C. (1992) Structure and stability of bovine casein micelles, Adv. Protein Chem., 43, 63-151, doi: 10.1016/S0065-3233(08)60554-9.

40. Foltmann, B. (1992) Chymosin: a short review on foetal and neonatal gastric proteases, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 52, 65-79, doi: 10.1080/00365519209104656.

41. Jensen, J. L., Mølgaard, A., Navarro Poulsen, J. C., Harboe, M. K., Simonsen, J. B., et al. (2013) Camel and bovine chymosin: the relationship between their structures and cheese-making properties, Acta Crystallogr. Sec. D Biol. Crystallogr., 69, 901-913, doi: 10.1107/S0907444913003260.

42. Fox, P. F., Guinee, T. P., Cogan, T. M., and McSweeney, P. L. H. (2016) Enzymatic coagulation of milk, in Fundamentals of Cheese Science, pp. 185-229, doi: 10.1007/978-1-4899-7681-9_7.

43. Costabel, L. M., Bergamini, C. V., Pozza, L., Cuffia, F., Candioti, M. C., and Hynes, E. (2015) Influence of chymosin type and curd scalding temperature on proteolysis of hard cooked cheeses, J. Dairy Res., 82, 375-384, doi: 10.1017/S0022029915000175.