БИОХИМИЯ, 2023, том 88, вып. 8, с. 1378–1391

УДК 576.522

Целостность и барьерная функция макрососудистого эндотелия не нарушаются при длительной экспериментальной гипергликемии in vitro

© 2023 А.Ю. Хапчаев *AYKhapchaev@cardio.ru, О.А. Антонова, О.А. Казакова, М.В. Самсонов, А.В. Воротников, В.П. Ширинский

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии имени академика Е.И. Чазова» Минздрава России, Институт экспериментальной кардиологии имени академика В.Н. Смирнова, 121552 Москва, Россия

Поступила в редакцию 13.01.2023
После доработки 08.07.2023
Принята к публикации 11.07.2023

DOI: 10.31857/S0320972523080079

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: HUVEC, эндотелиальный барьер, гипергликемия, инсулин, АФК, NO, РЛЦ миозина, MYPT1.

Аннотация

Гипергликемия является отличительной чертой сахарного диабета 2‑го типа (СД2), связанной с дисфункцией эндотелия сосудов и сердечно-сосудистыми осложнениями. Многие исследования in vitro обнаружили апоптоз эндотелиальных клеток как ранний результат экспериментальной гипергликемии и обозначили гибель клеток как ключевой фактор повреждения сосудов при СД2. Однако в условиях in vivo апоптоз не наблюдается вплоть до поздних стадий развития СД2. В данной работе мы исследовали долгосрочные (до 4 недель) эффекты высокой концентрации глюкозы (HG, 30 мМ) на эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC). HG не изменяла морфологию эндотелиального монослоя, уровень продукции АФК и NO и оказывала лишь незначительное влияние на маркеры апоптоза. Реакции эндотелиального барьера на различные воздействия не отличались от реакции клеток, культивируемых при физиологическом уровне глюкозы (LG, 5 мМ). Фокусируясь на ключевых регуляторах сократительной активности цитоскелета и эндотелиального барьера, мы не выявили различий в индуцированных гистамином изменениях внутриклеточного Ca2+ и уровня фосфорилирования регуляторных легких цепей миозина или фосфатазы легких цепей миозина. Полученные нами результаты показывают, что эндотелиальные клетки сосудов могут хорошо переносить относительно длительное воздействие HG, и нужны дальнейшие исследования для изучения механизмов развития сосудистых нарушений при прогрессирующем СД2.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи:

captcha

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Работа поддержана Российским научным фондом (грант № 19‑15‑00361) в части экспериментов по жизнеспособности HUVEC и долгосрочных экспериментов ECIS и Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 20‑015‑00565) в проведении других экспериментах.

Вклад авторов

Концептуализация и методология – А.Ю. Хапчаев, А.В. Воротников, В.П. Ширинский; проведение исследований – А.Ю. Хапчаев, О.А. Антонова, М.В. Самсонов, О.А. Казакова, А.В. Воротников; обработка полученных результатов – А.Ю. Хапчаев, А.В. Воротников; написание манускрипта – А.Ю. Хапчаев, А.В. Воротников; руководство – А.Ю. Хапчаев, А.В. Воротников, В.П. Ширинский; получение финансирования – А.Ю. Хапчаев, В.П. Ширинский.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Giugliano, D., Ceriello, A., and Paolisso, G. (1996) Oxidative stress and diabetic vascular complications, Diabetes Care, 19, 257-267, doi: 10.2337/diacare.19.3.257.

2. Goligorsky, M. S. (2017) Vascular endothelium in diabetes, Am. J. Physiol. Renal Physiol., 312, F266-F275, doi: 10.1152/ajprenal.00473.2016.

3. Bakker, W., Eringa, E. C., Sipkema, P., and van Hinsbergh, V. W. (2009) Endothelial dysfunction and diabetes: roles of hyperglycemia, impaired insulin signaling and obesity, Cell Tissue Res., 335, 165-189, doi: 10.1007/s00441-008-0685-6.

4. Del Turco, S., Gaggini, M., Daniele, G., Basta, G., Folli, F., Sicari, R., and Gastaldelli, A. (2013) Insulin resistance and endothelial dysfunction: a mutual relationship in cardiometabolic risk, Curr. Pharm. Des., 19, 2420-2431, doi: 10.2174/1381612811319130010.

5. Jansson, P. A. (2007) Endothelial dysfunction in insulin resistance and type 2 diabetes, J. Intern. Med., 262, 173-183, doi: 10.1111/j.1365-2796.2007.01830.x.

6. Knapp, M., Tu, X., and Wu, R. (2019) Vascular endothelial dysfunction, a major mediator in diabetic cardiomyopathy, Acta Pharmacol. Sin., 40, 1-8, doi: 10.1038/s41401-018-0042-6.

7. Varma, S., Lal, B. K., Zheng, R., Breslin, J. W., Saito, S., Pappas, P. J., Hobson, R. W., 2nd, and Durán, W. N. (2005) Hyperglycemia alters PI3k and Akt signaling and leads to endothelial cell proliferative dysfunction, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 289, H1744-H1751, doi: 10.1152/ajpheart.01088.2004.

8. Evans, J. L., Goldfine, I. D., Maddux, B. A., and Grodsky, G. M. (2002) Oxidative stress and stress-activated signaling pathways: a unifying hypothesis of type 2 diabetes, Endocr. Rev., 23, 599-622, doi: 10.1210/er.2001-0039.

9. Green, K., Brand, M. D., and Murphy, M. P. (2004) Prevention of mitochondrial oxidative damage as a therapeutic strategy in diabetes, Diabetes, 53, S110-S118, doi: 10.2337/diabetes.53.2007.s110.

10. Shah, M. S., Brownlee, M. (2016) Molecular and cellular mechanisms of cardiovascular disorders in diabetes, Circ. Res., 118, 1808-1829, doi: 10.1161/CIRCRESAHA.116.306923.

11. Jiménez, N., Krouwer, V. J., and Post, J. A. (2013) A new, rapid and reproducible method to obtain high quality endothelium in vitro, Cytotechnology, 65, 1-14, doi: 10.1007/s10616-012-9459-9.

12. Navone, S. E., Marfia, G., Invernici, G., Cristini, S., Nava, S., Balbi, S., Sangiorgi, S., Ciusani, E., Bosutti, A., Alessandri, G., Slevin, M., and Parati, E. A. (2013) Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells, Nat. Protoc., 8, 1680-1693, doi: 10.1038/nprot.2013.107.

13. Hauser, S., Jung, F., and Pietzsch, J. (2017) Human endothelial cell models in biomaterial research, Trends Biotechnol., 35, 265-277, doi: 10.1016/j.tibtech.2016.09.007.

14. Medina-Leyte, D. J., Domínguez-Pérez, M., Mercado, I., Villarreal-Molina, M. T., and Jacobo-Albavera, L. (2020) Use of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) as a model to study cardiovascular disease: a review, Appl. Sci., 10, 938, doi: 10.3390/app10030938.

15. Vorotnikov, A. V., Khapchaev, A. Yu., Nickashin, A. V., and Shirinsky, V. P. (2022) In vitro modeling of diabetes impact on vascular endothelium: Are essentials engaged to tune metabolism? Biomedicines, 10, 3181, doi: 10.3390/biomedicines10123181.

16. Van den Oever, I. A., Raterman, H. G., Nurmohamed, M. T., and Simsek, S. (2010) Endothelial dysfunction, inflammation, and apoptosis in diabetes mellitus, Mediators Inflamm., 2010, 792393, doi: 10.1155/2010/792393.

17. Gill, S. E., Rohan, M., and Mehta, S. (2015) Role of pulmonary microvascular endothelial cell apoptosis in murine sepsis-induced lung injury in vivo, Respir. Res., 16, 109, doi: 10.1186/s12931-015-0266-7.

18. Mallat, Z., and Tedgui, A. (2000) Apoptosis in the vasculature: mechanisms and functional importance, Br. J. Pharmacol., 130, 947-962, doi: 10.1038/sj.bjp.0703407.

19. Winn, R. K., and Harlan, J. M. (2005) The role of endothelial cell apoptosis in inflammatory and immune diseases, J. Thromb. Haemost., 3, 1815-1824, doi: 10.1111/j.1538-7836.2005.01378.x.

20. Quagliaro, L., Piconi, L., Assaloni, R., Martinelli, L., Motz, E., and Ceriello, A. (2003) Intermittent high glucose enhances apoptosis related to oxidative stress in human umbilical vein endothelial cells: the role of protein kinase C and NAD(P)H-oxidase activation, Diabetes, 52, 2795-2804, doi: 10.2337/diabetes.52.11.2795.

21. Risso, A., Mercuri, F., Quagliaro, L., Damante, G., and Ceriello, A. (2001) Intermittent high glucose enhances apoptosis in human umbilical vein endothelial cells in culture, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 281, E924-E930, doi: 10.1152/ajpendo.2001.281.5.E924.

22. Komarova, Y., and Malik, A. B. (2010) Regulation of endothelial permeability via paracellular and transcellular transport pathways, Annu. Rev. Physiol., 72, 463-493, doi: 10.1146/annurev-physiol-021909-135833.

23. Cahill, P. A., and Redmond, E. M. (2016) Vascular endothelium – Gatekeeper of vessel health, Atherosclerosis, 248, 97-109, doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2016.03.007.

24. Di, A., Mehta, D., and Malik, A. B. (2016) ROS-activated calcium signaling mechanisms regulating endothelial barrier function, Cell Calcium, 60, 163-171, doi: 10.1016/j.ceca.2016.02.002.

25. Rajendran, P., Rengarajan, T., Thangavel, J., Nishigaki, Y., Sakthisekaran, D., Sethi, G., and Nishigaki, I. (2013) The vascular endothelium and human diseases, Int. J. Biol. Sci., 9, 1057-1069, doi: 10.7150/ijbs.7502.

26. Goeckeler, Z. M., Bridgman, P. C., and Wysolmerski, R. B. (2008) Nonmuscle myosin II is responsible for maintaining endothelial cell basal tone and stress fiber integrity, Am. J. Physiol. Cell Physiol., 295, C994-C1006, doi: 10.1152/ajpcell.00318.2008.

27. Dalal, P. J., Muller, W. A., and Sullivan, D. P. (2020) Endothelial cell calcium signaling during barrier function and inflammation, Am. J. Pathol., 190, 535-542, doi: 10.1016/j.ajpath.2019.11.004.

28. Kugelmann, D., Rotkopf, L. T., Radeva, M. Y., Garcia-Ponce, A., Walter, E., and Waschke, J. (2018) Histamine causes endothelial barrier disruption via Ca2+-mediated RhoA activation and tension at adherens junctions, Sci. Rep., 8, 13229, doi: 10.1038/s41598-018-31408-3.

29. Van Nieuw Amerongen, G. P., Draijer, R., Vermeer, M. A., and van Hinsbergh, V. W. (1998) Transient and prolonged increase in endothelial permeability induced by histamine and thrombin: role of protein kinases, calcium, and RhoA, Circ. Res., 83, 1115-1123, doi: 10.1161/01.res.83.11.1115.

30. Khapchaev, A. Y., and Shirinsky, V. P. (2016) Myosin light chain kinase MYLK1: anatomy, interactions, functions, and regulation, Biochemistry (Moscow), 81, 1676-1697, doi: 10.1134/S000629791613006X.

31. Shimokawa, H., Sunamura, S., and Satoh, K. (2016) RhoA/Rho-kinase in the cardiovascular system, Circ. Res., 118, 352-366, doi: 10.1161/CIRCRESAHA.115.306532.

32. Kazakova, O. A., Khapchaev, A. Y., and Shirinsky, V. P. (2020) MLCK and ROCK mutualism in endothelial barrier dysfunction, Biochimie, 168, 83-91, doi: 10.1016/j.biochi.2019.10.010.

33. Ito, M., Nakano, T., Erdodi, F., and Hartshorne, D. J. (2004) Myosin phosphatase: structure, regulation and function, Mol. Cell. Biochem., 259, 197-209, doi: 10.1023/b:mcbi.0000021373.14288.00.

34. Kim, K. M., Csortos, C., Czikora, I., Fulton, D., Umapathy, N. S., Olah, G., and Verin, A. D. (2012) Molecular characterization of myosin phosphatase in endothelium, J. Cell. Physiol., 227, 1701-1708, doi: 10.1002/jcp.22894.

35. Beckers, C. M., Knezevic, N., Valent, E. T., Tauseef, M., Krishnan, R., Rajendran, K., Hardin, C. C., Aman, J., van Bezu, J., Sweetnam, P., van Hinsbergh, V. W., Mehta, D., and van Nieuw Amerongen, G. P. (2015) ROCK2 primes the endothelium for vascular hyperpermeability responses by raising baseline junctional tension, Vascul. Pharmacol., 70, 45-54, doi: 10.1016/j.vph.2015.03.017.

36. Birukova, A. A., Smurova, K., Birukov, K. G., Kaibuchi, K., Garcia, J. G., and Verin, A. D. (2004) Role of Rho GTPases in thrombin-induced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction, Microvasc. Res., 67, 64-77, doi: 10.1016/j.mvr.2003.09.007.

37. Wainwright, M. S., Rossi, J., Schavocky, J., Crawford, S., Steinhorn, D., Velentza, A. V., Zasadzki, M., Shirinsky, V., Jia, Y., Haiech, J., Van Eldik, L. J., and Watterson, D. M. (2003) Protein kinase involved in lung injury susceptibility: evidence from enzyme isoform genetic knockout and in vivo inhibitor treatment, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 6233-6238, doi: 10.1073/pnas.1031595100.

38. Langouche, L., Vanhorebeek, I., Vlasselaers, D., Vander Perre, S., Wouters, P. J., Skogstrand, K., Hansen, T. K., and Van den Berghe, G. (2005) Intensive insulin therapy protects the endothelium of critically ill patients, J. Clin. Invest., 115, 2277-2286, doi: 10.1172/JCI25385.

39. Nathan, D. M., Cleary, P. A., Backlund, J. Y., Genuth, S. M., Lachin, J. M., Orchard, T. J., Raskin, P., Zinman, B., and Diabetes control and complications trial/epidemiology of diabetes interventions and complications (DCCT/EDIC) study research group (2005) Intensive diabetes treatment and cardiovascular disease in patients with type 1 diabetes, N. Engl. J. Med., 353, 2643-2653, doi: 10.1056/NEJMoa052187.

40. Gunduz, D., Thom, J., Hussain, I., Lopez, D., Hartel, F. V., Erdogan, A., Grebe, M., Sedding, D., Piper, H. M., Tillmanns, H., Noll, T., and Aslam, M. (2010) Insulin stabilizes microvascular endothelial barrier function via phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt-mediated Rac1 activation, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 30, 1237-1245, doi: 10.1161/ATVBAHA.110.203901.

41. Samsonov, M. V., Podkuychenko, N. V., Lankin, V. Z., Vorotnikov, A. V., and Shirinsky, V. P. (2021) Malondialdehyde but not methylglyoxal impairs insulin signaling, NO production, and endothelial barrier, Biochemistry (Moscow) Suppl. Series A Memb. Cell Biol., 15, 195-200, doi: 10.1134/S1990747821030089.

42. Samsonov, M. V., Podkuychenko, N. V., Khapchaev, A. Y., Efremov, E. E., Yanushevskaya, E. V., Vlasik, T. N., Lankin, V. Z., Stafeev, I. S., Skulachev, M. V., Shestakova, M. V., Vorotnikov, A. V., and Shirinsky, V. P. (2022) AICAR protects vascular endothelial cells from oxidative injury induced by the long-term palmitate excess, Int. J. Mol. Sci., 23, 211, doi: 10.3390/ijms23010211.

43. Printseva, O., Peclo, M. M., and Gown, A. M. (1992) Various cell types in human atherosclerotic lesions express ICAM-1. Further immunocytochemical and immunochemical studies employing monoclonal antibody 10F3, Am. J. Pathol., 140, 889-896.

44. Segawa, K., and Nagata, S. (2015) An apoptotic “eat me” signal: phosphatidylserine exposure, Trends Cell Biol., 25, 639-650, doi: 10.1016/j.tcb.2015.08.003.

45. Bui, T. M., Wiesolek, H. L., and Sumagin, R. (2020) ICAM-1: a master regulator of cellular responses in inflammation, injury resolution, and tumorigenesis, J. Leukoc. Biol., 108, 787-799, doi: 10.1002/JLB.2MR0220-549R.

46. Porter, A. G., and Janicke, R. U. (1999) Emerging roles of caspase-3 in apoptosis, Cell Death Differ., 6, 99-104, doi: 10.1038/sj.cdd.4400476.

47. Antonova, O. A., Loktionova, S. A., Romanov, Y. A., Shustova, O. N., Khachikian, M. V., and Mazurov, A. V. (2009) Activation and damage of endothelial cells upon hypoxia/reoxygenation. Effect of extracellular pH, Biochemistry (Moscow), 74, 605-612, doi: 10.1134/s0006297909060030.

48. Kazakova, O. A., Khapchaev, A. Y., Ragimov, A. A., Salimov, E. L., and Shirinsky, V. P. (2019) Western blotting-based quantitative measurement of myosin II regulatory light chain phosphorylation in small amounts of non-muscle cells, Biochemistry (Moscow), 84, 11-19, doi: 10.1134/S0006297919010024.

49. Baumgartner-Parzer, S. M., Wagner, L., Pettermann, M., Grillari, J., Gessl, A., and Waldhausl, W. (1995) High-glucose – triggered apoptosis in cultured endothelial cells, Diabetes, 44, 1323-1327, doi: 10.2337/diab.44.11.1323.

50. Fan, W., Han, D., Sun, Z., Ma, S., Gao, L., Chen, J., Li, X., Li, X., Fan, M., Li, C., Huc, D., Wanga, Y., and Cao, F. (2017) Endothelial deletion of mTORC1 protects against hindlimb ischemia in diabetic mice via activation of autophagy, attenuation of oxidative stress and alleviation of inflammation, Free Radic. Biol. Med., 108, 725-740, doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2017.05.001.

51. Ido, Y., Carling, D., and Ruderman, N. (2002) Hyperglycemia-induced apoptosis in human umbilical vein endothelial cells: inhibition by the AMP-activated protein kinase activation, Diabetes, 51, 159-167, doi: 10.2337/diabetes.51.1.159.

52. Sheu, M. L., Ho, F. M., Yang, R. S., Chao, K. F., Lin, W. W., Lin-Shiau, S. Y., and Liu, S. H. (2005) High glucose induces human endothelial cell apoptosis through a phosphoinositide 3-kinase-regulated cyclooxygenase-2 pathway, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 25, 539-545, doi: 10.1161/01.ATV.0000155462.24263.e4.

53. Pal, P. B., Sonowal, H., Shukla, K., Srivastava, S. K., and Ramana, K. V. (2019) Aldose reductase regulates hyperglycemia-induced HUVEC death via SIRT1/AMPK-α1/mTOR pathway, J. Mol. Endocrinol., 63, 11-25, doi: 10.1530/JME-19-0080.

54. Kiss, A., Erdődi, F., and Lontay, B. (2019) Myosin phosphatase: unexpected functions of a long-known enzyme, Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Res., 1866, 2-15, doi: 10.1016/j.bbamcr.2018.07.023.

55. Federici, M., Menghini, R., Mauriello, A., Hribal, M. L., Ferrelli, F., Lauro, D., Sbraccia, P., Spagnoli, L. G., Sesti, G., and Lauro, R. (2002) Insulin-dependent activation of endothelial nitric oxide synthase is impaired by O-linked glycosylation modification of signaling proteins in human coronary endothelial cells, Circulation, 106, 466-472, doi: 10.1161/01.cir.0000023043.02648.51.

56. Lenin, R., Nagy, P. G., Jha, K. A., and Gangaraju, R. (2019) GRP78 translocation to the cell surface and O-GlcNAcylation of VE-Cadherin contribute to ER stress-mediated endothelial permeability, Sci. Rep., 9, 10783, doi: 10.1038/s41598-019-47246-w.