Дисплей олиго‑α‑1,6-гликозидазы Exiguobacterium sibiricum на поверхности клеток Escherichia coli

1 ФГБУН Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, Россия

2 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991 Москва, Россия

Поступила в редакцию 02.03.2023
После доработки 03.04.2023
Принята к публикации 04.04.2023

DOI: 10.31857/S0320972523050147

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: секреция, аутотранспортер, олиго‑α‑1,6-гликозидаза, бактериальный дисплей.

Аннотация

Олиго‑α‑1,6-гликозидазы широко применяются в биотехнологии для гидролиза крахмала. Клеточный дисплей, основанный на использовании якорных мотивов белков внешней мембраны, позволяет экспонировать целевые пептиды и белки на поверхности микробных клеток, что способствует созданию технологически и экологически оптимальной среды для получения целевого продукта. Ранее нами была получена и охарактеризована рекомбинантная олиго‑α‑1,6-гликозидаза психротрофной бактерии Exiguobacterium sibiricum (EsOgl), демонстрирующая высокую каталитическую активность. Было также показано, что аутотранспортер АТ877 Psychrobacter cryohalolentis и его делеционные варианты эффективно экспонируют эстеразу EstPc и 10‑й домен фибронектина III‑го типа на поверхности клеток Escherichia coli. Целью работы явилось получение системы дисплея EsOgl на поверхности бактериальных клеток на основе АТ877. Сконструированы гены гибридного аутотранспортера EsOgl877 и его делеционных мутантов EsOgl877Δ239 и EsOgl877Δ310. Исследована ферментативная активность EsOgl877 и установлено, что клетки, экспрессирующие этот белок, сохраняли около 90% максимальной активности в температурном диапазоне 15–35 °C. Показано, что активность клеток, содержащих EsOgl877Δ239 и EsOgl877Δ310, была соответственно в 2,7 и 2,4 раза выше, чем клеток, экспрессирующих полноразмерный АТ. Анализ клеток, экспрессирующих укороченные варианты EsOgl877, после обработки протеиназой К показал, что пассажирский домен во всех случаях локализован на клеточной поверхности. Полученные результаты могут быть использованы для оптимизации систем дисплея олиго‑α‑1,6-гликозидазы и других гетерологичных белков на поверхности клеток E. coli.

Текст статьи

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Работа выполнена в рамках Госзадания ИБХ РАН № FMFM-2019-0007 (0101-2019-0007).

Вклад авторов

Л.Н. Шингарова, Л.Е. Петровская, М.П. Кирпичников – концепция и руководство работой; Л.Н. Шингарова, Е.А. Крюкова, С.Ш. Гапизов – проведение экспериментов; Л.Н. Шингарова, Л.Е. Петровская, Д.А. Долгих – обсуждение результатов исследования; Л.Е. Петровская, Л.Н. Шингарова – написание текста статьи.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Van der Maarel, M. J. E. C., van der Veen, B., Uitdehaag, J. C. M., Leemhuis, H., and Dijkhuizen, L. (2002) Properties and applications of starch-converting enzymes of the α-amylase family, J. Biotechnol., 94, 137-155, doi: 10.1016/s0168-1656(01)00407-2.

2. Hua, X., and Yang, R. (2016) Enzymes in starch processing, in Enzymes in Food and Beverage Processing (Chandrasekaran, M. ed.) CRC Press, Boca Raton, FL, USA, pp. 139-170.

3. Dong, Z., Tang, C., Lu, Y., Yao, L., and Kan, Y. (2020) Microbial oligo‐α-1,6‐glucosidase: current developments and future perspectives, Starch Stärke, 72, 1900172, doi: 10.1002/star.201900172.

4. Watanabe, K., Hata, Y., Kizaki, H., Katsube, Y., and Suzuki, Y. (1997) The refined crystal structure of Bacillus cereus oligo-1,6-glucosidase at 2.0 Å resolution: structural characterization of proline-substitution sites for protein thermostabilization, J. Mol. Biol., 269, 142-153, doi: 10.1006/jmbi.1997.1018.

5. Watanabe, K., Kitamura, K., and Suzuki, Y. (1996) Analysis of the critical sites for protein thermostabilization by proline substitution in oligo-1,6-glucosidase from Bacillus coagulans ATCC 7050 and the evolutionary consideration of proline residues, Appl. Environ. Microbiol., 62, 2066-2073, doi: 10.1128/aem.62.6.2066-2073.1996.

6. Watanabe, K., Chishiro, K., Kitamura, K., and Suzuki, Y. (1991) Proline residues responsible for thermostability occur with high frequency in the loop regions of an extremely thermostable oligo-1,6-glucosidase from Bacillus thermoglucosidasius KP1006, J. Biol. Chem., 266, 24287-24294, doi: 10.1016/S0021-9258(18)54226-5.

7. Feller, G. (2013) Psychrophilic enzymes: from folding to function and biotechnology, Scientifica, 2013, 512840, doi: 10.1155/2013/512840.

8. Barroca, M., Santos, G., Gerday, C., and Collins, T. (2017) Biotechnological Aspects of Cold-Active Enzymes, in Psychrophiles: From Biodiversity to Biotechnology (Margesin, R. ed.) Springer International Publishing, Cham, pp. 461-475, doi: 10.1007/978-3-319-57057-0_19.

9. Berlina, Y. Y., Petrovskaya, L. E., Kryukova, E. A., Shingarova, L. N., Gapizov, S. S., Kryukova, M. V., Rivkina, E. M., Kirpichnikov, M. P., and Dolgikh, D. A. (2021) Engineering of Thermal stability in a cold-active oligo-1,6-glucosidase from Exiguobacterium sibiricum with unusual amino acid content, Biomolecules, 11, 1229, doi: 10.3390/biom11081229.

10. Van Ulsen, P., ur Rahman, S., Jong, W. S., Daleke-Schermerhorn, M. H., and Luirink, J. (2014) Type V secretion: from biogenesis to biotechnology, Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Res., 1843, 1592-1611, doi: 10.1016/j.bbamcr.2013.11.006.

11. Nicolay, T., Vanderleyden, J., and Spaepen, S. (2015) Autotransporter-based cell surface display in Gram-negative bacteria, Crit. Rev. Microbiol., 41, 109-123, doi: 10.3109/1040841X.2013.804032.

12. De Carvalho, C. C. (2017) Whole cell biocatalysts: essential workers from nature to the industry, Micr. Biotechnol., 10, 250-263, doi: 10.1111/1751-7915.12363.

13. Schüürmann, J., Quehl, P., Festel, G., and Jose, J. (2014) Bacterial whole-cell biocatalysts by surface display of enzymes: toward industrial application, Appl. Microbiol. Biotechnol., 98, 8031-8046, doi: 10.1007/s00253-014-5897-y.

14. He, M.-X., Feng, H., and Zhang, Y.-Z. (2008) Construction of a novel cell-surface display system for heterologous gene expression in Escherichia coli by using an outer membrane protein of Zymomonas mobilis as anchor motif, Biotechnol. Lett., 30, 2111-2117, doi: 10.1007/s10529-008-9813-3.

15. Ryu, S., and Karim, M. N. (2011) A whole cell biocatalyst for cellulosic ethanol production from dilute acid-pretreated corn stover hydrolyzates, Appl. Microbiol. Biotechnol., 91, 529-542, doi: 10.1007/s00253-011-3261-z.

16. Muñoz-Gutiérrez, I., Oropeza, R., Gosset, G., and Martinez, A. (2012) Cell surface display of a β-glucosidase employing the type V secretion system on ethanologenic Escherichia coli for the fermentation of cellobiose to ethanol, J. Indust. Microbiol. Biotechnol., 39, 1141-1152, doi: 10.1007/s10295-012-1122-0.

17. Soma, Y., Inokuma, K., Tanaka, T., Ogino, C., Kondo, A., Okamoto, M., and Hanai, T. (2012) Direct isopropanol production from cellobiose by engineered Escherichia coli using a synthetic pathway and a cell surface display system, J. Biosci. Bioeng., 114, 80-85, doi: 10.1016/j.jbiosc.2012.02.019.

18. Van Ulsen, P., Zinner, K. M., Jong, W. S. P., and Luirink, J. (2018) On display: autotransporter secretion and application, FEMS Microbiol. Lett., 365, fny165, doi: 10.1093/femsle/fny165.

19. Petrovskaya, L., Novototskaya-Vlasova, K., Kryukova, E., Rivkina, E., Dolgikh, D., and Kirpichnikov, M. (2015) Cell surface display of cold-active esterase EstPc with the use of a new autotransporter from Psychrobacter cryohalolentis K5T, Extremophiles, 19, 161-170, doi: 10.1007/s00792-014-0695-0.

20. Petrovskaya, L., Zlobinov, A., Shingarova, L., Boldyreva, E., Gapizov, S. S., Novototskaya-Vlasova, K., Rivkina, E., Dolgikh, D., and Kirpichnikov, M. (2018) Fusion with the cold-active esterase facilitates autotransporter-based surface display of the 10th human fibronectin domain in Escherichia coli, Extremophiles, 22, 141-150, doi: 10.1007/s00792-017-0990-7.

21. Shingarova, L., Petrovskaya, L., Zlobinov, A., Gapizov, S. S., Kryukova, E., Birikh, K., Boldyreva, E., Yakimov, S., Dolgikh, D., and Kirpichnikov, M. (2018) Construction of artificial TNF-binding proteins based on the 10th human fibronectin type III domain using bacterial display, Biochemistry (Moscow), 83, 708-716, doi: 10.1134/S0006297918060081.

22. Shingarova, L. N., Petrovskaya, L. E., Kryukova, E. A., Gapizov, S. S., Boldyreva, E. F., Dolgikh, D. A., and Kirpichnikov, M. P. (2022) Deletion variants of autotransporter from Psychrobacter cryohalolentis increase efficiency of ¹⁰FN3 exposure on the surface of Escherichia coli cells, Biochemistry (Moscow), 87, 932-939, doi: 10.1134/S0006297922090061.

23. Dalbey, R. E., and Kuhn, A. (2012) Protein traffic in Gram-negative bacteria – how exported and secreted proteins find their way, FEMS Microbiol. Rev., 36, 1023-1045, doi: 10.1111/j.1574-6976.2012.00327.x.

24. Kim, K. H., Aulakh, S., and Paetzel, M. (2012) The bacterial outer membrane beta-barrel assembly machinery, Prot. Sci., 21, 751-768, doi: 10.1002/pro.2069.

25. Peterson, J. H., Tian, P., Ieva, R., Dautin, N., and Bernstein, H. D. (2010) Secretion of a bacterial virulence factor is driven by the folding of a C-terminal segment, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 107, 17739-17744, doi: 10.1073/pnas.1009491107.

26. Junker, M., Besingi, R. N., and Clark, P. L. (2009) Vectorial transport and folding of an autotransporter virulence protein during outer membrane secretion, Mol. Microbiol., 71, 1323-1332, doi: 10.1111/j.1365-2958.2009.06607.x.

27. Renn, J. P., Junker, M., Besingi, R. N., Braselmann, E., and Clark, P. L. (2012) ATP-independent control of autotransporter virulence protein transport via the folding properties of the secreted protein, Chem. Biol., 19, 287-296, doi: 10.1016/j.chembiol.2011.11.009.

28. Braselmann, E., and Clark, P. L. (2012) Autotransporters: the Cellular environment reshapes a folding mechanism to promote protein transport, J. Phys. Chem. Lett., 3, 1063-1071, doi: 10.1021/jz201654k.

29. Siddiqui, K. S., and Cavicchioli, R. (2006) Cold-adapted enzymes, Annu. Rev. Biochem., 75, 403-433, doi: 10.1146/annurev.biochem.75.103004.142723.

30. Struvay, C., and Feller, G. (2012) Optimization to low temperature activity in psychrophilic enzymes, Int. J. Mol. Sci., 13, 11643-11665, doi: 10.3390/ijms130911643.

31. Santiago, M., Ramírez-Sarmiento, C. A., Zamora, R. A., and Parra, L. P. (2016) Discovery, molecular mechanisms, and industrial applications of cold-active enzymes, Front. Microbiol., 7, 1408, doi: 10.3389/fmicb.2016.01408.

32. Novototskaya‐Vlasova, K., Petrovskaya, L., Yakimov, S., and Gilichinsky, D. (2012) Cloning, purification, and characterization of a cold adapted esterase produced by Psychrobacter cryohalolentis K5T from Siberian cryopeg, FEMS Microbiol. Ecol., 82, 367-375, doi: 10.1111/j.1574-6941.2012.01385.x.