БИОХИМИЯ, 2022, том 87, вып. 11, с. 1667–1682
УДК 576.57.088.2, 576.57.088.3
Сравнение методов выделения микроРНК из экстраклеточных везикул, присутствующих в асцитической жидкости
1 НИИ канцерогенеза ФГБУ «НМИЦ онкологии имени Н.Н. Блохина» Минздрава России, 115478 Москва, Россия
2 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, 111234 Москва, Россия
3 НИИ клинической онкологии ФГБУ «НМИЦ онкологии имени Н.Н. Блохина» Минздрава России, 115478 Москва, Россия
Поступила в редакцию 24.08.2022
После доработки 21.09.2022
Принята к публикации 26.09.2022
DOI: 10.31857/S0320972522110124
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: экзосомы, микроРНК, методы выделения, экстраклеточные везикулы, miRNeasy Serum/Plasma Kit, Total Exosome RNA & Protein Isolation Kit, PureLink miRNA Isolation Kit, miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit.
Аннотация
Секретируемые экстраклеточные везикулы (ЭКВ) содержат активные биомолекулы, включая микроРНК, состав которых отражает эпигенетические изменения, возникающие в клетках при патологических процессах, в частности, злокачественной трансформации. Накопленный пул данных о роли ЭКВ в канцерогенезе обусловил поиск диагностических маркеров в составе ЭКВ. Важнейшим фактором, ограничивающим развитие данного направления, является отсутствие «золотых стандартов» как для методик выделения ЭКВ из биологических жидкостей, так и для анализа их молекулярного содержимого, включая состав микроРНК. В работе впервые проведено сравнение эффективности различных методов выделения малых РНК из ЭКВ, содержащихся в асцитической жидкости, для последующего анализа микроРНК. Сравнение различных коммерческих наборов показало преимущества методов, включающих фенол-хлороформную экстракцию: Total Exosome RNA & Protein Isolation Kit (TERPIK) и miRNeasy Serum/Plasma Kit (miRNeasy). Анализ транскриптома малых РНК в ЭКВ показал присутствие различных классов молекул, среди которых доля микроРНК в среднем составляла 6%, достигая 10% при использовании набора TERPIK. Набор PureLink miRNA Isolation Kit характеризовался наименьшей эффективностью. Набор miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (miRNeasy_A) показал максимальную концентрацию фракции малых РНК, доля микроРНК в которой, однако, не превышала таковую в случае использования наборов miRNeasy и TERPIK. Более того, данные ОТ-ПЦР анализа индивидуальных микроРНК показали более низкое содержание каждой из четырёх микроРНК – miR-1246, miR-200b-5p, miR-200c-3p и miR-23a-3p – при использовании набора miRNeasy_A. По совокупности исследуемых характеристик, включая концентрацию малых РНК, процент содержания микроРНК по данным биоанализатора (БА) и результатам секвенирования и уровень индивидуальных РНК, детектируемых методом ОТ-ПЦР, оптимальными можно считать наборы TERPIK и miRNeasy.
Текст статьи
Сноски
* Адресат для корреспонденции.
Финансирование
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 22-15-00373).
Благодарности
Измерения методом ТЭМ выполнены на базе Центра коллективного пользования «Электронная микроскопия в науках о жизни» биологического факультета МГУ.
Вклад авторов
Г.О. Скрябин – экспериментальные исследования: получение первичных данных, статистический анализ результатов, оформление иллюстраций, написание статьи; С.В. Винокурова – дизайн экспериментов по анализу индивидуальных микроРНК; Н.В. Елкина – экспериментальные исследования: разработка праймеров для анализа микроРНК, отработка условий для метода «StemLoop RT-PCR»; Д.А. Денисова – экспериментальные исследования: анализ экзосомальных маркеров, анализ микроРНК; А.А. Беляева – экспериментальные исследования: анализ траектории движения наночастиц; К.И. Жорданиа – забор клинических образцов асцитической жидкости; Д.В. Багров – экспериментальные исследования: трансмиссионная электронная микроскопия; А.Д. Еникеев – экспериментальные исследования: анализ размерного распределения и концентрации микроРНК; С.А. Галецкий – экспериментальные исследования: выделение экзосом из асцитической жидкости; А.В. Комельков – биоинформационный анализ данных глубокого секвенирования; Г.И. Краснощекова – клинико-морфологическая характеристика клинических образцов; Е.М. Чевкина – дизайн исследования, анализ литературных данных, анализ полученных результатов, редактирование статьи.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Соблюдение этических норм
Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 года и её последующим изменениям или сопоставимым нормам этики. От каждого из включённых в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.
Список литературы
1. Tsui, N. B., Ng, E. K., and Lo, Y. D. (2002) Stability of endogenous and added RNA in blood specimens, serum, and plasma, Clin. Chem., 48, 1647-1653, doi: 10.1093/clinchem/48.10.1647.
2. Arroyo, J. D., Chevillet, J. R., Kroh, E. M., Ruf, I. K., Pritchard, C. C., et al. (2011) Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108, 5003-5008, doi: 10.1073/pnas.1019055108.
3. Geekiyanage, H., Rayatpisheh, S., Wohlschlegel, J. A., Brown, R., and Ambros, V. (2020) Extracellular microRNAs in human circulation are associated with miRISC complexes that are accessible to anti-AGO2 antibody and can bind target mimic oligonucleotides, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 117, 24213-24223, doi: 10.1073/pnas.2008323117.
4. Michell, D. L., and Vickers, K. C. (2016) Lipoprotein carriers of microRNAs, Biochim. Biophys. Acta, 1861, 2069-2074, doi: 10.1016/j.bbalip.2016.01.011.
5. O’Brien, K., Breyne, K., Ughetto, S., Laurent, L. C., and Breakefield, X. O. (2020) RNA delivery by extracellular vesicles in mammalian cells and its applications, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 21, 585-606, doi: 10.1038/s41580-020-0251-y.
6. Li, C., Zhou, T., Chen, J., Li, R., Chen, H., et al. (2022) The role of exosomal miRNAs in cancer, J. Translat. Med., 20, 6, doi: 10.1186/s12967-021-03215-4.
7. Florijn, B. W., Duijs, J. M. G. J., Levels, J. H., Dallinga-Thie, G. M., Wang, Y., et al. (2019) Diabetic nephropathy alters the distribution of circulating angiogenic microRNAs among extracellular vesicles, HDL, and Ago-2, Diabetes, 68, 2287-2300, doi: 10.2337/db18-1360.
8. Théry, C., Witwer, K. W., Aikawa, E., Alcaraz, M. J., Anderson, J. D., et al. (2018) Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines, J. Extracell. Vesicles, 7, 1535750, doi: 10.1080/20013078.2018.1535750.
9. Dilsiz, N. (2020) Role of exosomes and exosomal microRNAs in cancer, Fut. Sci. OA, 6, FSO465, doi: 10.2144/fsoa-2019-0116.
10. Skryabin, G. O., Komelkov, A. V., Zhordania, K. I., Bagrov, D. V., Vinokurova, S. V., et al. (2022) Extracellular vesicles from uterine aspirates represent a promising source for screening markers of gynecologic cancers, Cells, 11, 1064, doi: 10.3390/cells11071064.
11. Skryabin, G. O., Vinokurova, S. V., Galetsky, S. A., Elkin, D. S., Senkovenko, A. M., et al. (2022) Isolation and characterization of extracellular vesicles from gastric juice, Cancers, 14, 3314, doi: 10.3390/cancers14143314.
12. Li, M., Zeringer, E., Barta, T., Schageman, J., Cheng, A., et al. (2014) Analysis of the RNA content of the exosomes derived from blood serum and urine and its potential as biomarkers, Philos. Transact. R. Soc. B Biol. Sci., 369, 20130502, doi: 10.1098/rstb.2013.0502.
13. Tosar, J. P., and Cayota, A. (2018) Detection and analysis of non-vesicular extracellular RNA, Methods Mol. Biol., 1740, 125-137, doi: 10.1007/978-1-4939-7652-2_10.
14. Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., and Nieuwland, R. (2014) Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation, J. Extracell. Vesicles, 3, 23262, doi: 10.3402/jev.v3.23262.
15. Martínez-González, E., Brochado-Kith, Ó., Gómez-Sanz, A., Martín-Carbonero, L., Jimenez-Sousa, M. Á., et al. (2020) Comparison of methods and characterization of small RNAs from plasma extracellular vesicles of HIV/HCV coinfected patients, Sci. Rep., 10, 11140, doi: 10.1038/s41598-020-67935-1.
16. Zhang, N., Hu, G., Myers, T. G., and Williamson, P. R. (2019) Protocols for the analysis of microRNA expression, biogenesis, and function in immune cells, Curr. Protoc. Immunol., 126, e78, doi: 10.1002/cpim.78.
17. Bryzgunova, O., Konoshenko, M., Zaporozhchenko, I., Yakovlev, A., and Laktionov, P. (2021) Isolation of cell-free miRNA from biological fluids: influencing factors and methods, Diagnostics, 11, 865, doi: 10.3390/diagnostics11050865.
18. Channavajjhala, S. K., Rossato, M., Morandini, F., Castagna, A., Pizzolo, F., et al. (2014) Optimizing the purification and analysis of miRNAs from urinary exosomes, Clin. Chem. Lab. Med., 52, 345-354, doi: 10.1515/cclm-2013-0562.
19. El-Khoury, V., Pierson, S., Kaoma, T., Bernardin, F., and Berchem, G. (2016) Assessing cellular and circulating miRNA recovery: the impact of the RNA isolation method and the quantity of input material, Sci. Rep., 6, 19529, doi: 10.1038/srep19529.
20. Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., and Piper, M. (2013) Analyzing the circulating microRNAs in exosomes/extracellular vesicles from serum or plasma by qRT-PCR, Methods Mol. Biol., 1024, 129-145, doi: 10.1007/978-1-62703-453-1_10.
21. Meerson, A., and Ploug, T. (2016) Assessment of six commercial plasma small RNA isolation kits using qRT-PCR and electrophoretic separation: higher recovery of microRNA following ultracentrifugation, Biol. Methods Protocols, 1, bpw003, doi: 10.1093/biomethods/bpw003.
22. Tang, Y.-T., Huang, Y.-Y., Zheng, L., Qin, S.-H., Xu, X.-P., et al. (2017) Comparison of isolation methods of exosomes and exosomal RNA from cell culture medium and serum, Int. J. Mol. Med., 40, 834-844, doi: 10.3892/ijmm.2017.3080.
23. Eldh, M., Lötvall, J., Malmhäll, C., and Ekström, K. (2012) Importance of RNA isolation methods for analysis of exosomal RNA: Evaluation of different methods, Mol. Immunol., 50, 278-286, doi: 10.1016/j.molimm.2012.02.001.
24. Záveský, L., Jandáková, E., Weinberger, V., Minář, L., Hanzíková, V., et al. (2019) Ascites-derived extracellular microRNAs as potential biomarkers for ovarian cancer, Reproduct. Sci., 26, 510-522, doi: 10.1177/1933719118776808.
25. Schindler, P., Kupcinskas, J., Juzenas, S., Skieceviciene, J., Salteniene, V., et al. (2018) Expression of microRNAs in the ascites of patients with peritoneal carcinomatosis and peritonitis, Cancer Cytopathol., 126, 353-363, doi: 10.1002/cncy.21966.
26. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., and Clayton, A. (2006) Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids, Curr. Protoc. Cell Biol., 3, 3.22.1-3.22.29, doi: 10.1002/0471143030.cb0322s30.
27. Skryabin, G. O., Komelkov, A. V., Galetsky, S. A., Bagrov, D. V., Evtushenko, E. G., et al. (2021) Stomatin is highly expressed in exosomes of different origin and is a promising candidate as an exosomal marker, J. Cell. Biochem., 122, 100-115, doi: 10.1002/jcb.29834.
28. Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., et al. (2005) Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR, Nucleic Acids Res., 33, e179, doi: 10.1093/nar/gni178.
29. Xu, Y. F., Hannafon, B. N., Khatri, U., Gin, A., and Ding, W. Q. (2019) The origin of exosomal miR-1246 in human cancer cells, RNA Biol., 16, 770-784, doi: 10.1080/15476286.2019.1585738.
30. Savolainen, K., Scaravilli, M., Ilvesmäki, A., Staff, S., Tolonen, T., et al. (2020) Expression of the miR-200 family in tumor tissue, plasma and urine of epithelial ovarian cancer patients in comparison to benign counterparts, BMC Res. Notes, 13, 311, doi: 10.1186/s13104-020-05155-6.
31. Laurent, L. C., Abdel-Mageed, A. B., Adelson, P. D., Arango, J., Balaj, L., et al. (2015) Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH extracellular RNA communication consortium, J. Extracell. Vesicles, 4, 26533, doi: 10.3402/jev.v4.26533.
32. Fernando, M. R., Jiang, C., Krzyzanowski, G. D., and Ryan, W. L. (2017) New evidence that a large proportion of human blood plasma cell-free DNA is localized in exosomes, PLoS One, 12, e0183915, doi: 10.1371/journal.pone.0183915.
33. Gallo, A., Tandon, M., Alevizos, I., and Illei, G. G. (2012) The Majority of microRNAs detectable in serum and saliva is concentrated in exosomes, PLоS One, 7, e30679, doi: 10.1371/journal.pone.0030679.
34. Van Niel, G., D’Angelo, G., and Raposo, G. (2018) Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 19, 213-228, doi: 10.1038/nrm.2017.125.
35. Record, M., Carayon, K., Poirot, M., and Silvente-Poirot, S. (2014) Exosomes as new vesicular lipid transporters involved in cell-cell communication and various pathophysiologies, Biochim. Biophys. Acta, 1841, 108-120, doi: 10.1016/j.bbalip.2013.10.004.
36. Skryabin, G. O., Komelkov, A. V., Savelyeva, E. E., and Tchevkina, E. M. (2020) Lipid rafts in exosome biogenesis, Biochemistry (Moscow), 85, 177-191, doi: 10.1134/S0006297920020054.
37. Frey, B., and Gaipl, U. S. (2011) The immune functions of phosphatidylserine in membranes of dying cells and microvesicles, Semin. Immunopathol., 33, 497-516, doi: 10.1007/s00281-010-0228-6.
38. Kastelowitz, N., and Yin, H. (2014) Exosomes and microvesicles: identification and targeting by particle size and lipid chemical probes, ChemBioChem, 15, 923-928, doi: 10.1002/cbic.201400043.
39. Monleau, M., Bonnel, S., Gostan, T., Blanchard, D., Courgnaud, V., et al. (2014) Comparison of different extraction techniques to profile microRNAs from human sera and peripheral blood mononuclear cells, BMC Genomics, 15, 395, doi: 10.1186/1471-2164-15-395.
40. Yuana, Y., Koning, R. I., Kuil, M. E., Rensen, P. C. N., Koster, A. J., et al. (2013) Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles in fresh plasma, J. Extracell. Vesicles, 2, 21494, doi: 10.3402/jev.v2i0.21494.
41. Zabeo, D., Cvjetkovic, A., Lässer, C., Schorb, M., Lötvall, J., et al. (2017) Exosomes purified from a single cell type have diverse morphology, J. Extracell. Vesicles, 6, 1329476, doi: 10.1080/20013078.2017.1329476.
42. Kim, Y.-K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., and Kim, V. N. (2012) Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells, Mol. Cell, 46, 893-895, doi: 10.1016/j.molcel.2012.05.036.
43. Brown, R. A. M., Epis, M. R., Horsham, J. L., Kabir, T. D., Richardson, K. L., et al. (2018) Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal, BMC Biotechnol., 18, 16, doi: 10.1186/s12896-018-0421-6.