Катионный канальный родопсин из водоросли Platymonas subcordiformis как перспективный оптогенетический инструмент

1 Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, 117485 Москва, Россия

2 Институт биохимической физики имени Н.М. Эмануэля РАН, 119334 Москва, Россия

3 Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, Россия

Поступила в редакцию 27.09.2022
После доработки 10.10.2022
Принята к публикации 10.10.2022

DOI: 10.31857/S0320972522110082

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: оптогенетика, нейрон, бактериальный опсин, канальный родопсин, светоиндуцированный ток, пэтч-кламп, внутриклеточная регистрация, Platymonas subcordiformis.

Статья на английском языке опубликована в режиме Open Access (открытого доступа) на сайте издательства Springer. DOI: 10.1134/S0006297922110116.

Аннотация

Развитие оптогенетики в значительной степени зависит от разработки новых молекулярных инструментов – светоактивируемых белков. Используя культивируемые нейроны гиппокампа, мы провели сравнение двух светоактивируемых катионных каналов: классического канального родопсина‑2 из Chlamydomonas reinhardtii (CrChR2) и недавно описанного канального родопсина, выделенного из водоросли Platymonas subcordiformis (PsChR2). Мы показали, что PsChR2 способен обеспечить генерацию потенциалов действия при импульсной световой стимуляции нейронов вплоть до частот в 40–50 Гц, в то время как верхний предел для CrChR2 составляет 20–30 Гц. Важным преимуществом PsChR2 по сравнению с классическим CrChR2 является сдвиг спектра его возбуждения в синюю область. Это открывает возможность для эффективного использования PsChR2 в экспериментах, построенных по принципу «all-optical electrophysiology», для которых необходимо разнести максимумы спектров канальных родопсинов, используемых для стимуляции нейрона, и спектров возбуждения различных красных флуоресцентных зондов. Мы провели сравнение ответов нейронов (генерации потенциалов действия), экспрессирующих CrChR2 и PsChR2, на световые стимулы с длиной волны 530 и 550 нм – наиболее часто используемые для возбуждения красных флуоресцентных зондов. Было показано, что свет с длиной волны 530 нм для нейронов, экспрессирующих PsChR2, гораздо (в 3,7 раза) менее эффективен, чем для экспрессирующих классический CrChR2. Свет же с длиной волны 550 нм даже при использованной нами максимальной интенсивности вообще не стимулирует нейроны, экспрессирующие любой из изученных опсинов. Это означает, что канальный родопсин PsChR2, выделенный из водоросли P. subcordiformis, и по своим частотным характеристикам, и по возможности его использования для стимуляции нейрона коротковолновым (синим, 470 нм) светом и одновременной регистрации различных физиологических процессов с помощью флуоресцентных зондов может рассматриваться как весьма перспективный оптогенетический инструмент.

Текст статьи

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение № 075-15-2020-795, внутренний номер 13.1902.21.0027).

Благодарности

Авторы благодарят О.Г. Щербакову за предоставление плазмиды с PsChR2.

Вклад авторов

А.Ю. Малышев, М.А. Островский – концепция и руководство работой; Г.Р. Смирнова, Л.Е. Петровская – проведение молекулярно-биологических экспериментов; О.С. Иджилова и Д.А. Колотова – проведение электрофизиологических экспериментов; А.Ю. Малышев, О.С. Иджилова и М.А. Островский – написание и редактирование текста.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим стандартам ФГБУН ИВНД и НФ РАН и утверждённым правовым актам РФ и международных организаций.

Список литературы

1. Montagni, E., Resta, F., Mascaro, A. L. A., and Pavone, F. S. (2019) Optogenetics in brain research: from a strategy to investigate physiological function to a therapeutic tool, Photonics, 6, 92, doi: 10.3390/photonics6030092.

2. Nagel, G., Szellas, T., Huhn, W., Kateriya, S., Adeishvili, N., et al. (2003) Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 13940-13945, doi: 10.1073/pnas.1936192100.

3. Boyden, E., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., and Deisseroth, K. (2005) Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity, Nat. Neurosci., 8, 1263-1268, doi: 10.1038/nn1525.

4. Govorunova, E., Sineshchekov, O., Janz, R., Liu, X., and Spudich, J. (2015) Natural light-gated anion channels: a family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics, Science, 349, 647-650, doi: 10.1126/science.aaa7484.

5. Arenkiel, B., Peca, J., Davison, I., Feliciano, C., Deisseroth, K., et al. (2007) In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2, Neuron, 54, 205-218, doi: 10.1016/j.neuron.2007.03.005.

6. Duan, X., Nagel, G., and Gao, S. (2019) Mutated channelrhodopsins with increased sodium and calcium permeability, Appl. Sci., 9, 664, doi: 10.3390/app9040664.

7. Wietek, J., and Prigge, M. (2016) Enhancing channelrhodopsins: an overview, in Methods in Molecular Biology (Clifton, N. J., ed) 1408, pp. 141-165, doi: 10.1007/978-1-4939-3512-3_10.

8. Govorunova, E., Sineshchekov, O., Li, H., Janz, R., and Spudich, J. (2013) Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis, J. Biol. Chem., 288, 29911-29922, doi: 10.1074/jbc.M113.505495.

9. Hochbaum, D., Zhao, Y., Farhi, S., Klapoetke, N., Werley, C. A., et al. (2014) All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins, Nat. Methods, 11, 825-833, doi: 10.1038/nmeth.3000.

10. Beaudoin, G., Lee, S.-H., Singh, D., Yuan, Y., Ng, Yu-G., et al. (2012) Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex, Nat. Protoc., 7, 1741-1754, doi: 10.1038/nprot.2012.099.

11. Van Rossum, G., and Drake, F. (2009) Python 3 Reference Manual, Scotts Valley, CA: CreateSpace.

12. Nakanishi, K., and Crouch, R. (1995) Application of artificial pigments to structure determination and study of photoinduced transformations of retinal proteins, Isr. J. Chem., 35, 253-272, doi: 10.1002/ijch.199500030.

13. Ullrich, S., Gueta, R., and Nagel, G. (2013) Degradation of channelopsin-2 in the absence of retinal and degradation resistance in certain mutants, Biol. Chem., 394, 271-280, doi: 10.1515/hsz-2012-0256.

14. Miesenböck, G., De Angelis, D., and Rothman, J. (1998) Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins, Nature, 394, 192-195, doi: 10.1038/28190.