Анализ активности стероидогенного регуляторного белка острой фазы (STARD1) человека в клетках Escherichia coli

1 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119234 Москва, Россия

2 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, 119234 Москва, Россия

3 Белорусский государственный университет, НИИ физико-химических проблем, 220030 Минск, Беларусь

4 ФГАОУ ВО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России, 119991 Москва, Россия

Поступила в редакцию 17.07.2022
После доработки 18.08.2022
Принята к публикации 19.08.2022

DOI: 10.31857/S0320972522090111

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: стероидогенный регуляторный белок острой фазы, Escherichia coli, холестерол, биотрансформация стероидов, флуоресценция.

Аннотация

Одним из главных препятствий для успешного использования в биотехнологических процессах клеток Escherichia coli, способных осуществлять трансформацию стероидов, является неэффективный транспорт в клетки стероидных субстратов. В работе тестирована возможность использования белка-переносчика холестерола человека – стероидогенного регуляторного белка острой фазы (STARD1) – для повышения эффективности поглощения стероидов клетками E. coli. Получены генетические конструкции для синтеза в клетках E. coli BL21(DE3) делетированной версии белка STARD1, включающей функциональный домен (66–285 аминокислотные остатки), или белка STARD1(66–285)-GFP, несущих на N‑конце последовательность бактериального белка pelB, адресующую белок в периплазму. Анализ препаратов клеток E. coli/pET22b/STARD1-GFP с использованием флуориметрии и Вестерн-иммуноблоттинга подтвердил, что использованная система экспрессии обеспечивает синтез полноразмерного гетерологичного белка. С использованием флуоресцентной спектроскопии показано, что присутствие STARD1 обеспечивает увеличение эффективности ассимиляции NBD-меченых аналогов холестерола клетками E. coli/pET22b/STARD1 в 1,3–1,6 раза (p < 0,05) в сравнении с клетками дикого штамма. Таким образом, впервые обнаружено, что STARD1 человека способен проявлять функциональную активность в клетках бактерий, что открывает перспективы для оптимизации и использования фундаментально нового подхода для повышения эффективности поглощения стероидов клетками – включения в мембрану клетки специфического белка-переносчика, который может расширить арсенал методов, использующихся при получении штаммов микроорганизмов для синтеза широко востребованных стероидных соединений.

Текст статьи

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 20-08-00467-а). Авторы выражают благодарность Случанко Н.Н. за предоставленные плазмиды pET-22b(+) и H-MBP-3C-STARD1_66–285.

Вклад авторов

Л.А. Новикова, М.А. Рубцов – концепция и руководство работой, написание текста; С.В. Замалутдинова, Л.В. Исаева, А.В. Замалутдинов, Я.В. Фалетров, Л.А. Новикова – проведение экспериментов; А.В. Замалутдинов – статистическая обработка результатов.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Kuhl, H. (2011) Pharmacology of progestogens, J. Reproduktionsmed. Endokrinol., 8, 157-176, doi: 10.1007/978-3-319-14385-9_2.

2. Fu, B., Ren, Q., Ma, J., Chen, Q., Zhang, Q., et al. (2022) Enhancing the production of physiologically active vitamin D3 by engineering the hydroxylase CYP105A1 and the electron transport chain, World J. Microbiol. Biotechnol., 38, 14, doi: 10.1007/s11274-021-03193-1.

3. Novikova, L. A., Faletrov Y. V., Kovaleva I. E., Mauersberger, S., Luzikov, V. N., et al. (2009) From structure and functions of steroidogenic enzymes to new technologies of gene engineering, Biochemistry (Moscow), 74, 1482-1504, doi:10.1134/s0006297909130057.

4. Mauersberger, S., Novikova, L. A., and Shkumatov, V. M. (2013) in Yarrowia Lipolytica. Microbiology Monographs (Barth, G., ed.) vol. 25. Springer, Berlin, Heidelberg, doi: 10.1007/978-3-642-38583-4_7.

5. Donova, M. V., and Egorova, O. V. (2012) Microbial steroid transformations: Current state and prospects, Appl. Microbiol. Biotechnol., 94, 1423-1447, doi: 10.1007/s00253-012-4078-0.

6. Efimova, V. S., Isaeva, L. V., Rubtsov, M. A., and Novikova, L. A. (2019) Analysis of in vivo activity of the bovine cholesterol hydroxylase/lyase system proteins expressed in Escherichia coli, Mol. Biotechnol., 61, 261-273, doi: 10.1007/s12033-019-00158-6.

7. Thevenieau, F., Beopoulos, F., Desfougeres, T., Sabirova, J., Albertin, K., et al. (2010) in Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology (Timmis, K., ed.) 2nd Edn Springer, Berlin, Heidelberg, pp. 1514-1527.

8. Liu, W.-H., Horng, W.-C., and Tsai, M.-S. (1996) Bioconversion of cholesterol to cholest-4-en-3-one in aqueous/organic solvent two-phase reactors, Enzyme Microb. Technol., 18, 184-189, doi: 10.1016/0141-0229(95)00091-7.

9. Clark, B. J., Wells, J., King, S. R., and Stocco, D. M. (1994) The purification, cloning, and expression of a novel luteinizing hormone-induced mitochondrial protein in MA-10 mouse Leydig tumor cells. Characterization of the steroidogenic acute regulatory protein (StAR), J. Biol. Chem., 269, 28314-28322.

10. Kallen, C. B., Billheimer, J. T., Summers, S. A., Stayrook, S. E., Lewis, M., et al. (1998) Steroidogenic acute regulatory protein (StAR) is a sterol transfer protein, J. Biol. Chem., 273, 26285-26288, doi: 10.1074/jbc.273.41.26285.

11. Arakane, F., Sugawara, T., Nishino, H., Liu, Z., Holt, J. A., et al. (1996) Steroidogenic acute regulatory protein (StAR) retains activity in the absence of its mitochondrial import sequence: Implications for the mechanism of StAR action, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 13731-13736, doi: 10.1073/pnas.93.24.13731.

12. Arakane, F., Kallen, C. B., Watari, H., Foster, J. A., Sepuri, N. B. V., et al. (1998) The mechanism of action of steroidogenic acute regulatory protein (StAR). StAR acts on the outside of mitochondria to stimulate steroidogenesis, J. Biol. Chem., 273, 16339-16345, doi: 10.1074/jbc.273.26.16339.

13. Sluchanko, N. N., Tugaeva, K. V., Faletrov, Y. V., and Levitsky, D. I. (2016) High-yield soluble expression, purification and characterization of human steroidogenic acute regulatory protein (StAR) fused to a cleavable Maltose-Binding Protein (MBP), Protein Expr. Purif., 119, 27-35, doi: 10.1016/j.pep.2015.11.002.

14. Faletrov,Y., Brzostek, A., Plocinska, R., Dziadek, J., Rudaya, E., et al. (2017) Uptake and metabolism of fluorescent steroids by mycobacterial cells, Steroids, 117, 29-37, doi: 10.1016/j.steroids.2016.10.001.

15. Efimova, V. S., Isaeva, L. V., Labudina, A. A., Tashlitsky, V. N., Rubtsov, M. A., et al. (2019) Polycistronic expression of the mitochondrial steroidogenic P450scc system in the HEK293T cell line, J. Cell. Biochem., 120, 3124-3136, doi: 10.1002/jcb.27577.

16. Sambrook, J., and Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.

17. Studier, F. W. (2005) Protein production by auto-induction in high density shaking cultures, Protein Expr. Purif., 41, 207-34. doi: 10.1016/j.pep.2005.01.016.

18. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685, doi: 10.1038/227680a0.

19. Towbin, H., Staehelin, T., and Gordon, J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354, doi: 10.1073/pnas.76.9.4350.

20. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., and Randall, R. J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 193, 265-270.

21. R. Core Team (2021) R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria.

22. Tugaeva, K. V., and Sluchanko, N. N. (2019) Steroidogenic acute regulatory protein: structure, functioning, and regulation, Biochemistry (Moscow), 84, 233-253, doi: 10.1134/S0006297919140141.

23. Efimova, V., Faletrov, Y., Isaeva, L., Novikova, L., Rubtsov, M., et al. (2015) Interaction of NBD-labelled fluorescent steroids and a fatty acid with Escherichia coli, FEBS J., 282, Suppl. 1, p. 135, doi: 10.1111/febs.13321.

24. Tugaeva, K. V., Faletrov, Y. V., Allakhverdiev, E. S., Shkumatov, V. M., Maksimov, E. G., et al. (2018) Effect of the NBD-group position on interaction of fluorescently-labeled cholesterol analogues with human steroidogenic acute regulatory protein STARD1, Biochem. Biophys. Res. Commun., 497, 58-64, doi: 10.1016/j.bbrc.2018.02.014.

25. Sugawara, T., Holt, J. A., Driscoll, D., Strauss, J. F. 3rd, Lin, D., et al. (1995) Human steroidogenic acute regulatory protein: functional activity in COS-1 cells, tissue-specific expression, and mapping of the structural gene to 8p11.2 and a pseudogene to chromosome 13, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4778-4782, doi: 10.1073/pnas.92.11.4778.

26. King, S. R., Liu, Z., Soh, J., Eimerl, S., Orly, J., et al. (1999) Effects of disruption of the mitochondrial electrochemical gradient on steroidogenesis and the Steroidogenic Acute Regulatory (StAR) protein, J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 69, 143-154, doi: 10.1016/s0960-0760(98)00152-6.