БИОХИМИЯ, 2022, том 87, вып. 9, с. 1246–1259

УДК 579.873.11: 579.66

Рекомбинантная внеклеточная холестериноксидаза из Nocardioides simplex

© 2022 В.В. Фокина 1*2vvfokina@gmail.com, М.В. Карпов 1, В.В. Коллеров 1, Е.Ю. Брагин 1, Д.О. Эпиктетов 1, А.В. Свиридов 1, А.В. Казанцев 2, А.А. Шутов 1, М.В. Донова 1

Федеральный исследовательский центр “Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук”, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН, 142290 Пущино, Московская обл., Россия

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991 Москва, Россия

Поступила в редакцию 05.07.2022
После доработки 01.08.2022
Принята к публикации 01.08.2022

DOI: 10.31857/S0320972522090068

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: холестерин, холестериноксидаза, актинобактерии, рекомбинантный фермент.

Аннотация

Холестериноксидаза (ХО) – фермент, крайне востребованный в медицине, фармацевтике, сельском хозяйстве, химии и биотехнологии. ХО катализирует окисление 3β‑гидрокси-5‑ен‑фрагмента стероидного ядра с формированием продукта с 3‑кето-4‑ен‑структурой и образованием перекиси водорода. Объектом исследования являлась внеклеточная ХО актинобактериального штамма Nocardioides simplex ВКМ Ас‑2033Д. Зрелая форма ХО N. simplex (55,6 кДа) с 6xHis-меткой была получена путём экспрессии в клетках Escherichia coli соответствующей нуклеотидной последовательности. Выделение и очистку рекомбинантной ХО N. simplex (ХОNs) проводили с помощью аффинной хроматографии. Фермент проявлял активность по отношению к холестерину, холестанолу, фитостерину, прегненолону и дегидроэпиандростерону. Активность ХО зависела от структуры и длины алифатической боковой цепи при С17 стероида и была ниже для прегненолона и дегидроэпиандростерона. ХОNs проявляла активность в диапазоне рН 5,25÷6,5 с оптимумом рН 6,0. Анализ кинетических характеристик и тестов на стабильность при хранении показал, что показатели ХОNs сравнимы или превосходят таковые для коммерческой ХО из Streptomyces hygroscopicus (ХОSh). Результаты расширяют знания о микробных ХО и свидетельствуют о том, что ХО из N. simplex ВКМ Ас‑2033Д перспективна для дальнейшего практического применения.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 21-64-00024).

Вклад авторов

В.В. Фокина, М.В. Карпов, В.В. Коллеров – концепция и проведение экспериментов; Д.О. Эпиктетов, А.В. Свиридов – проведение экспериментов; Е.Ю. Брагин – биоинформатический анализ; А.В. Казанцев – МС- и ЯМР-анализ; А.А. Шутов – ВЭЖХ-анализ; В.В. Фокина, М.В. Карпов, В.В. Коллеров, А.В. Свиридов – обсуждение результатов исследования и написание текста; М.В. Донова – руководство работой и редактирование текста статьи.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Kreit, J. (2017) Microbial catabolism of sterols: focus on the enzymes that transform the sterol 3β-hydroxy-5-en into 3-keto-4-en, FEMS Microbiol. Lett., 364, fnx007, doi: 10.1093/femsle/fnx007.

2. Lario, P. I., Sampson, N., and Vrielink, A. (2003) Sub-atomic resolution crystal structure of cholesterol oxidase: What atomic resolution crystallography reveals about enzyme mechanism and the role of the FAD cofactor in redox activity, J. Mol. Biol., 326, 1635-1650, doi: 10.1016/S0022-2836(03)00054-8.

3. Salè, F. O., Marchesini, S., Fishman, P. H., and Berra, B. (1984) A sensitive enzymatic assay for determination of cholesterol in lipid extracts, Anal. Biochem., 142, 347-350, doi: 10.1016/0003-2697(84)90475-5.

4. Doukyu, N. (2009) Characteristics and biotechnological applications of microbial cholesterol oxidases, Appl. Microbiol. Biotechnol., 83, 825-837, doi: 10.1007/s00253-009-2059-8.

5. Heath, R. S., Sangster, J. J., and Turner, N. J. (2022) An engineered cholesterol oxidase catalyses enantioselective oxidation of non-steroidal secondary alcohols, Chembiochem., 23, e202200075, doi: 10.1002/cbic.202200075.

6. Corbin, D. R., Greenplate, J. T., Wong, E. Y., Purcell, J. P. (1994) Cloning of an insecticidal cholesterol oxidase gene and its expression in bacteria and in plant protoplasts, Appl. Environ. Microbiol., 60, 4239-4244, doi: 10.1128/aem.60.12.4239-4244.1994.

7. El-Naggar, N. El.-A., Soliman, H. M., and El-Shweihy, N. M. (2018) Extracellular cholesterol oxidase production by Streptomyces aegyptia, in vitro anticancer activities against rhabdomyosarcoma, breast cancer cell-lines and in vivo apoptosis, Sci. Rep., 8, 2706, doi: 10.1038/s41598-018-20786-3.

8. Kreit, J., and Sampson, N. S. (2009) Cholesterol oxidase: physiological functions, FEBS J., 276, 6844-6856, doi: 10.1111/j.1742-4658.2009.07378.x.

9. Navas, J., González-Zorn, B., Ladrón, N., Garrido, P., and Vázquez-Boland, J. A. (2001) Identification and mutagenesis by allelic exchange of choE, encoding a cholesterol oxidase from the intracellular pathogen Rhodococcus equi, J. Bacteriol., 183, 4796-4805, doi: 10.1128/JB.183.16.4796-4805.2001.

10. García, J. L., Uhía, I., and Galán, B. (2012) Catabolism and biotechnological applications of cholesterol degrading bacteria, Microb. Biotechnol., 5, 679-699, doi: 10.1111/j.1751-7915.2012.00331.x.

11. Fokina, V. V., Sukhodol’skaya, G. V., Gulevskaya, S. A., Gavrish, E. Y., Evtushenko, L. I., et al. (2003) The 1(2)-dehydrogenation of steroid substrates by Nocardioides simplex VKM Ac-2033D, Mikrobiologiia, 72, 24-29, doi: 10.1023/A:1022265720470.

12. Shtratnikova, V. Y., Schelkunov, M. I., Fokina, V. V., Bragin, E. Y., Lobastova, T. G., et al. (2020) Genome-wide transcriptome profiling provides insight on cholesterol and lithocholate degradation mechanisms in Nocardioides simplex VKM Ac-2033D, Genes, 11, 1229, doi: 10.3390/genes11101229.

13. Текучева Д. Н., Фокина В. В., Николаева В. М., Шутов А. А., Карпов М. В., и др. (2022) Каскадная биоконверсия фитостерина в тестостерон штаммами Mycolicibacterium neoaurum ВКМ Ас-1815Д и Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д, Микробиология, 91, 353-363, doi: 10.31857/S0026365622300097.

14. Bertani, G. (1951) Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli, J. Bacteriol., 62, 293-300, doi: 10.1128/jb.62.3.293-300.1951.

15. Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M., et al. (2011) MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods, Mol. Biol. Evol., 28, 2731-2739, doi: 10.1093/molbev/msr121.

16. Teufel, F., Almagro Armenteros, J. J., Johansen A. R., Gíslason, M. H., Pihl, S. I., et al. (2022) SignalP 6.0 predicts all five types of signal peptides using protein language models, Nat. Biotechnol., 03, doi: 10.1038/s41587-021-01156-3.

17. Sambrook, J., and Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.

18. Laеmmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Naturе, 227, 680-685, doi: 10.1038/227680a0.

19. Britton, H. T. K., Robinson, R. A. (1931) CXCVIII. Universal buffer solutions and the dissociation constant of veronal, J. Chem. Soc., 1456-1462, doi: 10.1039/JR9310001456.

20. Alshawafi, W. M., Aldhahri, M., Almulaiky, Y. Q., Salah, N., Moselhy, S. S. et al. (2018) Immobilization of horseradish peroxidase on nonwoven polyester fabric coated with chitosan. Artif. Cells Nanomed. Biotechnol., 46 (sup3), S973-S981, doi: 10.1080/21691401.2018.1522321.

21. Ladrón, N., Fernández, M., Agüero, J., González Zörn, B., Vázquez-Boland, J. A., et al. (2003) Rapid identification of Rhodococcus equi by a PCR assay targeting the choE gene, J. Clin. Microbiol., 41, 3241-3245, doi: 10.1128/JCM.41.7.3241-3245.2003.

22. Kämpfer, P., Dott, W., Martin, K., and Glaeser, S. P. (2014) Rhodococcus defluvii sp. nov., isolated from wastewater of a bioreactor and formal proposal to reclassify [Corynebacterium hoagii] and Rhodococcus equi as Rhodococcus hoagii comb. nov., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 64, 755-761, doi: 10.1099/ijs.0.053322-0.

23. Lolekha, P. H., Srisawasdi, P., Jearanaikoon, P., Wetprasit, N., Sriwanthana, B., et al. (2004) Performance of four sources of cholesterol oxidase for serum cholesterol determination by the enzymatic endpoint method, Clin. Chim. Acta, 339, 135-145, doi: 10.1016/j.cccn.2003.10.005.

24. Fokina, V. V., Sukhodolskaya, G. V., Baskunov, B. P., Turchin, K. F., Grinenko, G. S., et al. (2003) Microbial conversion of pregna-4,9(11)-diene-17α,21-diol-3,20-dione acetates by Nocardioides simplex VKM Ac-2033D, Steroids, 68, 415-421. doi: 10.1016/S00039-128X(03)00043-6.

25. Sukhodolskaya, G., Fokina, V., Shutov, A., Nikolayeva, V., Savinova, T., et al. (2017) Bioconversion of 6-(N-methyl-N-phenyl) aminomethyl androstane steroids by Nocardioides simplex, Steroids, 118, 9-16, doi: 10.1016/j.steroids.2016.11.001.

26. Gadda, G., Wels, G., Pollegioni, L., Zucchelli, S., Ambrosius, D., et al. (1997) Characterization of cholesterol oxidase from Streptomyces hygroscopicus and Brevibacterium sterolicum, Eur. J. Biochem., 250, 369-376, doi: 10.1111/j.1432-1033.1997.0369a.x.

27. Yue, Q. K., Kass, I. J., Sampson, N. S., and Vrielink, A. (1999) Crystal structure determination of cholesterol oxidase from Streptomyces and structural characterization of key active site mutants, Biochemistry, 38, 4277-4286, doi: 10.1021/bi982497j.

28. Jeong, J. M., and Young-Sun, J. (2008) A simple and rapid method for screening of Nocardioides simplex mutant with high cholesterol oxidase activity, Appl. Biol. Chem., 51, 338-341 doi: 10.3839/jksabc.2008.058.

29. Shtratnikova, V. Y., Schelkunov, M. I., Fokina, V. V., Pekov, Y. A., Ivashina, T., et al. (2017) Genome-wide bioinformatics analysis of steroid metabolism-associated genes in Nocardioides simplex VKM Ac-2033D, Curr. Genet., 62, 643-656, doi:10.1007/s00294-016-0568-4.

30. Qin, H. M., Wang, J. W., Guo, Q., Li, S., Xu, P., et al. (2017) Refolding of a novel cholesterol oxidase from Pimelobacter simplex reveals dehydrogenation activity, Protein Expr. Purif., 139, 1-7, doi: 10.1016/j.pep.2017.07.008.

31. Qin, H. M., Zhu, Z., Ma, Z., Xu, P., Guo, Q., et al. (2017) Rational design of cholesterol oxidase for efficient bioresolution of cholestane skeleton substrates, Sci. Rep., 7, 16375, doi: 10.1038/s41598-017-16768-6.

32. Devi, S., and Kanwar, S. S. (2017) Cholesterol oxidase: source, properties and applications, Insights Enzyme Res., 1, 1, doi: 10.21767/2573-4466.100005.

33. Srisawasdi, P., Jearanaikoon, P., Kroll, M. H., and Lolekha, P. H. (2005) Performance characteristics of cholesterol oxidase for kinetic determination of total cholesterol, J. Clin. Lab. Anal., 19, 247-252, doi: 10.1002/jcla.20086.

34. Kumari, L., and Kanwar, S. S. (2012) Cholesterol oxidase and its applications, Adv. Microbiol., 2, 49-65, doi: 10.4236/aim.2012.22007.