БИОХИМИЯ, 2022, том 87, вып. 9, с. 1223–1231

УДК 577.22

Делеционные варианты аутотранспортера Psychrobacter cryohalolentis повышают эффективность экспонирования 10FN3 на поверхности клеток Escherichia coli

© 2022 Л.Н. Шингарова 1*lshingarova@gmail.com, Л.Е. Петровская 1, Е.А. Крюкова 1, С.Ш. Гапизов 1,2, Е.Ф. Болдырева 1, Д.А. Долгих 1,2, М.П. Кирпичников 1,2

ФГБУН Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, Россия

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991 Москва, Россия

Поступила в редакцию 16.06.2022
После доработки 11.07.2022
Принята к публикации 11.07.2022

DOI: 10.31857/S0320972522090044

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: секреция, аутотранспортер, делеционные варианты, 10‑й домен фибронектина человека IIIbго типа, бактериальный дисплей.

Аннотация

Аутотранспортер АТ877 Psychrobacter cryohalolentis относится к семейству белков внешней мембраны, содержащих N‑концевой пассажирский и С‑концевой транслокаторный домены и составляющих основу для конструирования систем дисплея на поверхности клеток бактерий. Ранее мы показали, что пассажирский домен АТ877 может быть заменен холодоактивной эстеразой EstPc или 10‑м доменом фибронектина III‑го типа (10Fn3). С целью повышения эффективности поверхностного дисплея 10Fn3 в клетках Escherichia coli получены 4 делеционных варианта гибридного аутотранспортера Fn877. Установлено, что все варианты обнаруживаются в мембране бактериальных клеток и обеспечивают связывание специфических к 10Fn3 антител на поверхности клетки. Наиболее высокий уровень связывания обеспечивают варианты Δ239 и Δ310, содержащие 4 и 7 бета-тяжей из 12, составляющих структуру транслокаторного домена. С помощью электрофореза в полунативных условиях продемонстрировано наличие тепловой модифицируемости полноразмерного Fn877 и его делеционных вариантов, что указывает на сохранение бета-структуры в их молекулах. Полученные результаты могут быть использованы для оптимизации систем бактериального дисплея 10Fn3, а также других гетерологичных пассажирских доменов.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение № 075-15-2021-1354 от 07.10.2021).

Вклад авторов

Л.Н. Шингарова, Л.Е. Петровская, М.П. Кирпичников – концепция и руководство работой; Л.Н. Шингарова, Е.А. Крюкова, С.Ш. Гапизов, Е.Ф. Болдырева – проведение экспериментов; Л.Н. Шингарова, Л.Е. Петровская, Д.А. Долгих – обсуждение результатов исследования; Л.Е. Петровская, Л.Н. Шингарова – написание текста статьи.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Dautin, N., and Bernstein, H. D. (2007) Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway, Annu. Rev. Microbiol., 61, 89-112, doi: 10.1146/annurev.micro.61.080706.093233.

2. Van Ulsen, P., ur Rahman, S., Jong, W. S., Daleke-Schermerhorn, M. H., and Luirink, J. (2014) Type V secretion: from biogenesis to biotechnology, Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Res., 1843, 1592-1611, doi: 10.1016/j.bbamcr.2013.11.006.

3. Grijpstra, J., Arenas, J., Rutten, L., and Tommassen, J. (2013) Autotransporter secretion: varying on a theme, Res. Microbiol., 164, 562-582, doi: 10.1016/j.resmic.2013.03.010.

4. Leyton, D. L., Rossiter, A. E., and Henderson, I. R. (2012) From self sufficiency to dependence: mechanisms and factors important for autotransporter biogenesis, Nat. Rev. Microbiol., 10, 213-225, doi: 10.1038/nrmicro2733.

5. Selkrig, J., Leyton, D. L., Webb, C. T., and Lithgow, T. (2014) Assembly of β-barrel proteins into bacterial outer membranes, Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Res., 1843, 1542-1550, doi: 10.1016/j.bbamcr.2013.10.009.

6. Ieva, R., Tian, P., Peterson, J. H., and Bernstein, H. D. (2011) Sequential and spatially restricted interactions of assembly factors with an autotransporter β domain, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 108, E383-E391, doi: 10.1073/pnas.1103827108.

7. Kim, K. H., Aulakh, S., and Paetzel, M. (2012) The bacterial outer membrane beta-barrel assembly machinery, Prot. Sci., 21, 751-768, doi: 10.1002/pro.2069.

8. Lee, S. Y., Choi, J. H., and Xu, Z. (2003) Microbial cell-surface display, Trends Biotechnol., 21, 45-52, doi: 10.1016/s0167-7799(02)00006-9.

9. Nicolay, T., Vanderleyden, J., and Spaepen, S. (2015) Autotransporter-based cell surface display in Gram-negative bacteria, Crit. Rev. Microbiol., 41, 109-123, doi: 10.3109/1040841X.2013.804032.

10. Van Ulsen, P., Zinner, K. M., Jong, W. S. P., and Luirink, J. (2018) On display: autotransporter secretion and application, FEMS Microbiol. Lett., 365, fny165, doi: 10.1093/femsle/fny165.

11. Jose, J., Maas, R. M., and Teese, M. G. (2012) Autodisplay of enzymes – molecular basis and perspectives, J. Biotechnol., 161, 92-103, doi: 10.1016/j.jbiotec.2012.04.001.

12. Wu, C. H., Mulchandani, A., and Chen, W. (2008) Versatile microbial surface-display for environmental remediation and biofuels production, Trends Microbiol., 16, 181-188, doi: 10.1016/j.tim.2008.01.003.

13. Petrovskaya, L., Novototskaya-Vlasova, K., Kryukova, E., Rivkina, E., Dolgikh, D., et al. (2015) Cell surface display of cold-active esterase EstPc with the use of a new autotransporter from Psychrobacter cryohalolentis K5T, Extremophiles, 19, 161-170, doi: 10.1007/s00792-014-0695-0.

14. Novototskaya‐Vlasova, K., Petrovskaya, L., Yakimov, S., and Gilichinsky, D. (2012) Cloning, purification, and characterization of a cold adapted esterase produced by Psychrobacter cryohalolentis K5T from Siberian cryopeg, FEMS Microbiol. Ecol., 82, 367-375, doi: 10.1111/j.1574-6941.2012.01385.x.

15. Petrovskaya, L., Zlobinov, A., Shingarova, L., Boldyreva, E., Gapizov, S. S., et al. (2018) Fusion with the cold-active esterase facilitates autotransporter-based surface display of the 10th human fibronectin domain in Escherichia coli, Extremophiles, 22, 141-150, doi: 10.1007/s00792-017-0990-7.

16. Gebauer, M., and Skerra, A. (2020) Engineered protein scaffolds as next-generation therapeutics, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 60, 391-415, doi: 10.1146/annurev-pharmtox-010818-021118.

17. Chandler, P. G., and Buckle, A. M. (2020) Development and differentiation in monobodies based on the fibronectin type 3 domain, Cells9, 610, doi: 10.3390/cells9030610.

18. Akkapeddi, P., Teng, K. W., and Koide, S. (2021) Monobodies as tool biologics for accelerating target validation and druggable site discovery, RSC Med. Chem., 12, 1839-1853, doi: 10.1039/d1md00188d.

19. Plaxco, K. W., Spitzfaden, C., Campbell, I. D., and Dobson, C. M. (1997) A comparison of the folding kinetics and thermodynamics of two homologous fibronectin type III modules, J. Mol. Biol., 270, 763-770, doi: 10.1006/jmbi.1997.1148.

20. Shingarova, L., Petrovskaya, L., Zlobinov, A., Gapizov, S. S., Kryukova, E., et al. (2018) Construction of artificial TNF-binding proteins based on the 10th human fibronectin type III domain using bacterial display, Biochemistry (Moscow), 83, 708-716, doi: 10.1134/S0006297918060081.

21. Noinaj, N., Kuszak, A. J., and Buchanan, S. K. (2015) Heat modifiability of outer membrane proteins from Gram-negative bacteria, Methods Mol. Biol. (Clifton, N.J.), 1329, 51-56, doi: 10.1007/978-1-4939-2871-2_4.

22. Van den Berg, B. (2010) Crystal structure of a full-length autotransporter, J. Mol. Biol., 396, 627-633, doi: 10.1016/j.jmb.2009.12.061.

23. Miroux, B., and Walker, J. E. (1996) Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels, J. Mol. Biol., 260, 289-298, doi: 10.1006/jmbi.1996.0399.

24. Petrovskaya, L. E., Ziganshin, R. H., Kryukova, E. A., Zlobinov, A. V., Gapizov, S. S., et al. (2021) Increased synthesis of a magnesium transporter MgtA during recombinant autotransporter expression in Escherichia coli, Appl. Biochem. Biotechnol., 193, 3672-3703, doi: 10.1007/s12010-021-03634-5.

25. Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., and Fleming, K. G. (2008) β-Barrel proteins that reside in the Escherichia coli outer membrane in vivo demonstrate varied folding behavior in vitro, J. Biol. Chem., 283, 26748-26758, doi: 10.1074/jbc.M802754200.

26. Peterson, J. H., Tian, P., Ieva, R., Dautin, N., and Bernstein, H. D. (2010) Secretion of a bacterial virulence factor is driven by the folding of a C-terminal segment, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 107, 17739-17744, doi: 10.1073/pnas.1009491107.

27. Renn, J. P., Junker, M., Besingi, R. N., Braselmann, E., and Clark, P. L. (2012) ATP-independent control of autotransporter virulence protein transport via the folding properties of the secreted protein, Chem. Biol., 19, 287-296, doi: 10.1016/j.chembiol.2011.11.009.

28. Junker, M., Besingi, R. N., and Clark, P. L. (2009) Vectorial transport and folding of an autotransporter virulence protein during outer membrane secretion, Mol. Microbiol., 71, 1323-1332, doi: 10.1111/j.1365-2958.2009.06607.x.

29. Oomen, C. J., van Ulsen, P., Van Gelder, P., Feijen, M., Tommassen, J., et al. (2004) Structure of the translocator domain of a bacterial autotransporter, EMBO J., 23, 1257-1266, doi: 10.1038/sj.emboj.7600148.

30. Doyle, M. T., and Bernstein, H. D. (2021) BamA forms a translocation channel for polypeptide export across the bacterial outer membrane, Mol. Cell, 81, 2000-2012.e2003, doi: 10.1016/j.molcel.2021.02.023.

31. Robert, V., Volokhina, E. B., Senf, F., Bos, M. P., Gelder, P. V., et al. (2006) Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif, PLoS Biol., 4, e377, doi: 10.1371/journal.pbio.0040377.

32. Struyvé, M., Moons, M., and Tommassen, J. (1991) Carboxy-terminal phenylalanine is essential for the correct assembly of a bacterial outer membrane protein, J. Mol. Biol., 218, 141-148, doi: 10.1016/0022-2836(91)90880-f.

33. Celik, N., Webb, C. T., Leyton, D. L., Holt, K. E., Heinz, E., et al. (2012) A bioinformatic strategy for the detection, classification and analysis of bacterial autotransporters, PLoS One, 7, e43245, doi: 10.1371/journal.pone.0043245.

34. Meng, G., Surana, N. K., St. Geme III, J. W., and Waksman, G. (2006) Structure of the outer membrane translocator domain of the Haemophilus influenzae Hia trimeric autotransporter, EMBO J., 25, 2297-2304, doi: 10.1038/sj.emboj.7601132.

35. Dhar, R., and Slusky, J. S. (2021) Outer membrane protein evolution, Curr. Opin. Str. Biol., 68, 122-128, doi: 10.1016/j.sbi.2021.01.002.

36. Arnold, T., Poynor, M., Nussberger, S., Lupas, A. N., and Linke, D. (2007) Gene duplication of the eight-stranded β-barrel OmpX produces a functional pore: a scenario for the evolution of transmembrane β-barrels, J. Mol. Biol., 366, 1174-1184, doi: 10.1016/j.jmb.2006.12.029.

37. Koebnik, R. (1996) In vivo membrane assembly of split variants of the E. coli outer membrane protein OmpA, EMBO J., 15, 3529-3537.

38. Debnath, D., Nielsen, K. L., and Otzen, D. (2010) In vitro association of fragments of a β-sheet membrane protein, Biophys. Chem., 148, 112-120, doi: 10.1016/j.bpc.2010.03.004.