БИОХИМИЯ, 2022, том 87, вып. 6, с. 816–828

УДК 577.151.4

Мультифункциональный фермент с эндоглюканазной и альгиназо/глюкуронан-лиазной активностью из бактерии Cellulophaga lytica

© 2022 А.В. Лисов 1*ssl208@rambler.ru, С.С. Киселев 2, Л.И. Трубицина 1, О.В. Белова 1, Ж.И. Андреева-Ковалевская 1, И.В. Трубицин 1, Т.В. Шушкова 1, А.А. Леонтьевский 1

Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований РАН», Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, 142290 Пущино, Московская обл., Россия

Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований РАН», Институт биофизики клетки РАН, 142290 Пущино, Московская обл., Россия

Поступила в редакцию 18.04.2022
После доработки 30.05.2022
Принята к публикации 30.05.2022

DOI: 10.31857/S0320972522060094

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: GH5‑эндоглюканаза, PL31‑альгиназа, мультифункционалный фермент, осахаривание микроводорослей.

Аннотация

Cellulophaga lytica – грамотрицательная аэробная бактерия, в геноме которой обнаружено множество генов, кодирующих ферменты, расщепляющие полисахариды. Один из ферментов, названный ClGP, содержит домен гликозил-гидролазы семейства GH5 и домен полисахарид-лиазы семейства PL31. Фермент также содержит TAT-сигнальный пептид и TIGR04183-домен, что указывает на внеклеточную природу ClGP. Филогенетический анализ показывает, что наиболее близкие к ClGP и содержащие TAT-сигнальный пептид и домены GH5, PL31 и TIGR04183 ферменты, широко распространены среди бактерий, принадлежащих к семейству Flavobacteriaceae. ClGP, продуцируемый рекомбинантным штаммом Escherichia coli, был очищен и охарактеризован. ClGP демонстрирует эндоглюканазную (EC 3.2.1.4) активность и катализирует гидролиз β‑D‑глюкана, натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ‑Na), аморфной целлюлозы, но не кристаллической целлюлозы и ксилана. Продуктами гидролиза КМЦ‑Na являются целлобиоза и целлотриоза, при гидролизе β‑D‑глюкана обнаруживаются глюкоза, целлобиоза, целлотетроза и целлопентоза. ClGP наиболее эффективен с поли‑β-D‑маннуронатными, чем с поли‑α-L‑гулуронатными участками альгиновой кислоты. В связи с этим можно предположить, что ClGP является PolyM-лиазой (EC 4.2.2.3). ClGP активен по отношению к полиглюкуроновой кислоте, что указывает на его глюкуронан-лиазную активность (EC 4.2.2.14). Фермент отличается нейтральным рН-оптимумом, стабильностью в диапазоне рН 6,0–8,0 и невысокой термостабильностью. ClGP эффективно осахаривает два вида бурых водорослей, Saccharina latissima и Laminaria digitata, что в дальнейшем позволяет использовать его в производстве биотоплива из макроводорослей.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Работа частично поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 18‑07‑00899).

Вклад авторов

А.В. Лисов, А.А. Леонтьевский – концепция и руководство работой, написание и редактирование текста статьи; Л.И. Трубицина, Т.В. Шушкова, О.В. Белова, Ж.И. Андреева-Ковалевская, И.В. Трубицин – проведение экспериментов; С.С. Киселев – обсуждение результатов исследования, работа с базами данных.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Gorshkova, T. A., Kozlova, L. V., and Mikshina, P. V. (2013) Spatial structure of plant cell wall polysaccharides and its functional significance, Biochemistry (Moscow), 78, 836-853, doi: 10.1134/S0006297913070146.

2. Stone, B., Svensson, B., Collins, M., and Rastall, R. (2008) Polysaccharide degradation, in Fraser-Reid BO (Tatsuta, K., and Thiem, J., eds) Glycoscience, Springer, Berlin, Heidelberg, pp. 2325-2375.

3. Linhardt, R. J., Galliher, P. M., and Cooney, C. L. (1987) Polysaccharide lyases, Appl. Biochem. Biotechnol., 12, 135-176, doi: 10.1007/BF02798420.

4. Forsberg, Z., Sørlie, M, Petrović, D., Courtade, G., Aachmann, F. L., et al. (2019) Polysaccharide degradation by lytic polysaccharide monooxygenases, Curr. Opin. Struct. Biol., 59, 54-64, doi: 10.1016/j.sbi.2019.02.015.

5. Baldrian, P., and Valásková, V. (2008) Degradation of cellulose by basidiomycetous fungi, FEMS Microbiol. Rev., 32, 501-521, doi: 10.1111/j.1574-6976.2008.00106.x.

6. Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., and Henrissat, B. (2014) The carbo­hydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013, Nucleic Acids Res., 42, D490-D495, doi: 10.1093/nar/gkt1178.

7. Henrissat, B. A. (1991) Classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities, Biochem. J., 280, 309-316, doi: 10.1042/bj2800309

8. Chhabra, S. R., Shockley, K. R., Ward, D. E., and Kelly, R. M. (2002) Regulation of endo-acting glycosyl hydrolases in the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima grown on glucan- and mannan-based polysaccharides, Appl. Environ. Microbiol., 68, 545-54, doi: 10.1128%2FAEM.68.2.545-554.2002.

9. Yuan, S. F., Wu, T. H., Lee, H. L., Hsieh, H. Y., Lin, W. L., et al. (2015) Biochemical characterization and structural analysis of a bifunctional cellulase/xylanase from Clostridium thermocellum, J. Biol. Chem., 290, 5739-5748, doi: 10.1074%2Fjbc.M114.604454.

10. Tan, H., Miao, R., Liu, T., Yang, L., Yang, Y., et al. (2018) A bifunctional cellulase-xylanase of a new Chryseobacterium strain isolated from the dung of a straw-fed cattle, Microb. Biotechnol., 11, 381-398, doi: 10.1111/1751-7915.13034.

11. Flint, H. J., Martin, J., McPherson, C. A., Daniel, A. S., and Zhang, J. X. (1993) A bifunctional enzyme, with separate xylanase and b(1,3-1,4)-glucanase domains, encoded by the xynD gene of Ruminococcus flavefaciens, J. Bacteriol., 175, 2943-2951, doi: 10.1128/jb.175.10.2943-2951.1993.

12. Holck, J., Djajadi, D. T., Brask, J., Pilgaard, B., Krogh, K. B. R. M., et al. (2019) Novel xylanolytic triple domain enzyme targeted at feruloylated arabinoxylan degradation, Enzyme Microb. Technol., 129, 109353, doi: 10.1016/j.enzmictec.2019.05.010.

13. Kobayashi, T., Sawada, K., Sumitomo, N., Hatada, Y., Hagihara, H., et al. (2003) Bifunctional pectinolytic enzyme with separate pectate lyase and pectin methylesterase domains from an alkaliphilic Bacillus, W. J. Microbiol. Biotechnol., 19, 269-277, doi: 10.1023/A:1023698007103.

14. Johansen, J. E., Nielsen, P., and Sjøholm, C. (1999) Description of Cellulophaga baltica gen. nov., sp. nov. and Cellulophaga fucicola gen. nov., sp. nov. and reclassification of [Cytophaga] lytica to Cellulophaga lytica gen. nov., comb. nov, Int. J. Syst. Bacteriol., 49, 1231-1240, doi: 10.1099/00207713-49-3-1231.

15. Pati, A., Abt, B., Teshima, H, Nolan, M., Lapidus, A., et al. (2011) Complete genome sequence of Cellulophaga lytica type strain (LIM-21), Stand. Genomic Sci., 29, 221-232, doi: 10.4056/sigs.1774329.

16. Elboutachfaiti, R., Delattre, C., Petit, E., and Michaud, P. (2011) Polyglucuronic acids: structures, functions and degrading enzymes, Carb. Polym., 84, 1-13, doi: 10.1016/j.carbpol.2010.10.063.

17. Domozych, D. (2019) Algal Cell Walls, John Wiley & Sons, Ltd, Chichester, doi: 10.1002/9780470015902.a0000315.pub4.

18. Haug, A., Larsen, B., and Smidsrød, O. (1966) A study of the constitution of alginic acid by partial acid hydrolysis, Acta Chem. Scand., 20, 183-190, doi: 10.1016/B978-0-08-011841-3.50043-4.

19. Isogai, A., and Kato, Y. (1998) Preparation of polyuronic acid from cellulose by TEMPO-mediated oxidation, Cellulose, 5, 153-164, doi: 10.1023/A:1009208603673.

20. Jia, X., Chen, Y., Shi, C., Ye, Y., Wang, P., et al. (2013) Preparation and characterization of cellulose regenerated from phosphoric acid, J. Agric. Food Chem., 61, 12405-12414, doi: 10.1021/jf4042358.

21. Ghose, T. K. (1987) Measurement of cellulase activities, Pure App. Chem., 59, 257-268, doi: 10.1351/pac198759020257.

22. Suberkropp, K. (2005) Pectin-Degrading Enzymes: Polygalacturonase and Pectin Lyase in Methods to Study Litter Decomposition (Graça, M. A. C., Bärlocher, F., and Gessner, M. O., eds) Springer, Dordrecht, pp. 267-271, doi: 10.1007/1-4020-3466-0_36.

23. Britton, H. T. K., and Robinson, R. A. (1931) Universal buffer solutions and the dissociation constant of veronal, J. Chem. Soc., 1456-1462, doi: 10.1039/JR9310001456.

24. Lisov, A. V., Belova, O. V., Lisova, Z. A., Vinokurova, N. G., Nage, A. S., et al. (2017) Xylanases of Cellulomonas flavigena: expression, biochemical characterization, and biotechnological potential, AMB Express, 7, doi: 10.1186%2Fs13568-016-0308-7.

25. Edgar, R. C. (2004) MUSCLE: Multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput, Nucleic Acids Res., 32, 1792-1797, doi: 10.1093/nar/gkh340.

26. Kalyaanamoorthy, S., Minh, B. Q., Wong, T. K. F., von Haeseler, A., and Jermiin, L. S. (2017) ModelFinder: fast model selection for accurate phylogenetic estimates, Nat. Methods, 14, 587-589, doi: 10.1038/nmeth.4285.

27. Nguyen, L. T., Schmidt, H. A., von Haeseler, A., and Minh, B. Q. (2015) IQ-TREE: A fast and effective stochastic algorithm for estimating maximum likelihood phylogenies, Mol. Biol. Evol., 32, 268-274, doi: 10.1093/molbev/msu300.

28. Hoang, D. T., Chernomor, O., von Haeseler, A., Minh, B. Q., and Vinh, L. S. (2018) UFBoot2: Improving the ultrafast bootstrap approximation, Mol. Biol. Evol., 5, 518-522, doi: 10.1093/molbev/msx281.

29. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., and Kumar, S. (2013) MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0, Mol. Biol. Evol., 30, 2725-2729, doi: 10.1093/molbev/mst197.

30. Kulkarni, S. S., Zhu, Y., Brendel, C. J., and McBride, M. J. (2017) Diverse C-terminal sequences involved in Flavobacterium johnsoniae protein secretion, J. Bacteriol., 199, e00884-16, doi: 10.1128/JB.00884-16.

31. Whelan, S., and Goldman, N. (2001) A general empirical model of protein evolution derived from multiple protein families using a maximum-likelihood approach, Mol. Biol. Evol., 18, 691-699, doi: 10.1093/oxfordjournals.molbev.a003851.

32. Gu, X., Fu, Y. X., and Li, W. H. (1995) Maximum likelihood estimation of the heterogeneity of substitution rate among nucleotide sites, Mol. Biol. Evol., 12, 546-557, doi: 10.1093/oxfordjournals.molbev.a040235.

33. Payne, C. M., Knott, B. C., Mayes, H. B., Hansson, H., Himmel, M. E., et al. (2015) Fungal cellulases, Chem. Rev., 115, 1308-1448, doi: 10.1021/cr500351c.

34. Zhu, B., and Yin, H. (2015) Alginate lyase: review of major sources and classification, properties, structure-function analysis and applications, Bioengineered, 6, 125-131, doi: 10.1080/21655979.2015.1030543.

35. Roesijadi, G., Jones, S. B., Snowden-Swan, L. J., and Zhu, Y. (2010). Macroalgae as a Biomass Feedstock: A Preliminary Analysis, Pacific Northwest National Lab. (PNNL), Richland, WA (United States), doi: 10.2172/1006310.

36. Fernand, F., Israel, A., Skjermo, J., Wichard, T., Timmermans, K. R., et al. (2017) Offshore macroalgae biomass for bioenergy production: environmental aspects, technological achievements and challenges, Renew. Sust. Energ. Rev., 75, 35-45, doi: 10.1016/j.rser.2016.10.046.

37. Jung, K. A., Lim, S. R., Kim, Y., and Park, J. M. (2013) Potentials of macroalgae as feedstocks for biorefinery, Bioresour. Technol., 135, 182-190, doi: 10.1016/j.biortech.2012.10.025.

38. Plotkin, A. S., Railkin, A. I., Gerasimova, E. I., Pimenov, A. Yu., and Sipenkova, T. M. (2005) Subtidal underwater rock communities of the White Sea: struc­ture and interaction with bottom flow, Russ. J. Mar. Biol., 31, 335-343, doi: 10.1007/s11179-006-0001-9.

39. Schiener, P., Black, K. D., Stanley, M. S., and Green, D. H. (2015) The seasonal variation in the chemical composition of the kelp species Laminaria digitata, Laminaria hyperborea, Saccharina latissima and Alaria esculenta, J. Appl. Phycol., 27, 363-373, doi: 10.1007/s10811-014-0327-1.

40. Zheng, F., Tu, T., Wang, X., Wang, Y., Ma, R., et al. (2018) Enhancing the catalytic activity of a novel GH5 cellulase GtCel5 from Gloeophyllum trabeum CBS 900.73 by site-directed mutagenesis on loop 6, Biotechnol. Biofuels, 11, doi: 10.1186/s13068-018-1080-5.

41. Wang, W., Archbold, T., Lam, J. S., Kimber, M. S., and Fan, M. Z. (2019) A processive endoglucanase with multi-substrate specificity is characterized from porcine gut microbiota, Sci. Rep., 9, 13630, doi: 10.1038/s41598-019-50050-1.

42. Wu, B., Zheng, S., Pedroso, M. M., Guddat, L. W., Chang, S., et al. (2018) Processivity and enzymatic mechanism of a multifunctional family 5 endoglucanase from Bacillus subtilis BS-5 with potential applications in the saccharification of cellulosic substrates, Biotechnol. Biofuels, 11, doi: 10.1186%2Fs13068-018-1022-2.

43. Karlsson, J., Momcilovic, D., Wittgren, B., Schülein, M., Tjerneld, F., et al. (2002) Enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose hydrolyzed by the endoglucanases Cel5A, Cel7B, and Cel45A from Humicola insolens and Cel7B, Cel12A and Cel45Acore from Trichoderma reesei, Biopolymers, 63, 32-40, doi: 10.1002/bip.1060.

44. Leis, B., Held, C., Bergkemper, F., Dennemarck, K., Steinbauer, R., et al. (2017) Comparative character­ization of all cellulosomal cellulases from Clostridium thermocellum reveals high diversity in endoglucanase product formation essential for complex activity, Bio­technol. Biofuels, 10, doi: 10.1186/s13068-017-0928-4.

45. Usman, A., Khalid, S., Usman, A., Hussain, Z., and Wang, Y. (2017) Algal Polysaccharides, Novel Application, and Outlook, in Algae Based Polymers, Blends, and Composites Chemistry, Biotechnology and Materials Science (Zia, K. M., Zuber, M., and Ali, M., eds) Elsevier, pp. 115-153, doi: 10.1016/B978-0-12-812360-7.00005-7.

46. Rasmussen, R. S., and Morrissey, M. T. (2007) Marine biotechnology for production of food ingredients, Adv. Food Nutr. Res., 52, 237-292, doi: 10.1016/S1043-4526(06)52005-4.

47. Itoh, T., Nakagawa, E., Yoda, M., Nakaichi, A., Hibi, T., et al. (2019) Structural and biochemical characterisation of a novel alginate lyase from Paenibacillus sp. str. FPU-7, Sci. Rep., 9, 14870, doi: 10.1038/s41598-019-51006-1.

48. Wong, T. Y., Preston, L. A., and Schiller, N. L. (2000) Alginate lyase: review of major sources and enzyme characteristics, structure-function analysis, biological roles, and applications, Annu. Rev. Microbiol., 54, 289-340, doi: 10.1146/annurev.micro.54.1.289.

49. Tavernier, M. L., Delattre, C., Petit, E., and Michaud, P. (2008) b-(1,4)-Polyglucuronic acids – an overview, Open Biotech. J., 2, 73-86, doi: 10.2174/1874070700802010073.

50. Helbert, W., Poulet, L., Drouillard, S., Mathieu, S., Loiodice, M., et al. (2019) Discovery of novel carbohydrate-active enzymes through the rational exploration of the protein sequences space, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 116, 6063-6068, doi: 10.1073/pnas.1815791116.

51. MacDonald, L. C., Weiler, E. B., and Berger, B. W. (2016) Engineering broad-spectrum digestion of polyuronides from an exolytic polysaccharide lyase, Biotechnol. Biofuels, 9, doi: 10.1186/s13068-016-0455-8.

52. Gavriilidou, A., Gutleben, J., Versluis, D., Forgiarini, F., van Passel, M. W. J., et al. (2020) Comparative genomic analysis of Flavobacteriaceae: insights into carbohydrate metabolism, gliding motility and secondary metabolite biosynthesis, BMC Genomics, 21, doi: 10.1186/s12864-020-06971-7.

53. Tsung, K., Inouye, S., and Inouye, M. (1989) Factors affecting the efficiency of protein synthesis in Escherichia coli. Production of a polypeptide of more than 6000 amino acid residues, J. Biol. Chem., 264, 4428-4433, doi: 10.1016/S0021-9258(18)83760-7.

54. Frain, K. M., Robinson, C., and van Dijl, J. M. (2019) Transport of folded proteins by the tat system, Protein J., 38, 377-388, doi: 10.1007/s10930-019-09859-y.

55. Singh, P., Sharma, L., Kulothungan, S. R., Adkar, B. V., Prajapati, R. S., et al. (2013) Effect of signal peptide on stability and folding of Escherichia coli thioredoxin, PLoS One, 8, e63442, doi: 10.1371/journal.pone.0063442.

56. Natale, P., Brüser, T., and Driessen, A. J. (2008) Sec- and Tat-mediated protein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane – distinct translocases and mechanisms, Biochim. Biophys. Acta, 1778, 1735-1756, doi: 10.1016/j.bbamem.2007.07.015.

57. Adams, J. M., Gallagher, J. A., and Donnison, I. S. (2009) Fermentation study on Saccharina latissima for bioethanol production considering variable pre-treatments, J. Appl. Phycol., 21, 569-574, doi: 10.1007/s10811-008-9384-7.

58. Yoo, G., Park, M. S., and Yang, J.-W. (2015) Chemical Pretreatment of Algal Biomass, in Pretreatment of Biomass. Processes and Technologies (Pandey, A., Negi, S., Binod, P., and Larroche, C., eds) 1st Edn., Elsevier, pp. 227-258, doi: 10.1016/B978-0-12-800080-9.00012-8.

59. Hernández, D., Riaño, B., Coca, M., and García-González, M. C. (2015) Saccharification of carbo­hydrates in microalgal biomass by physical, chemical and enzymatic pre-treatments as a previous step for bioethanol production, Chem. Eng. J., 262, 939-945, doi: 10.1016/j.cej.2014.10.049.

60. Gimpel, J. A., Ravanal, M. C., Salazar, O., and Lienqueo, M. E. (2018) Saccharification of brown macroalgae using an arsenal of recombinant alginate lyases: potential application in the biorefinery process, J. Microbiol. Biotechnol., 28, 1671-1682, doi: 10.4014/jmb.1805.05056.

61. Manns, D., Nyffenegger, C., Saake, B., and Meyer, A. S. (2016) Impact of different alginate lyases on combined cellulase–lyase saccharification of brown seaweed, RSC Adv., 6, 45392-45401, doi: 10.1039/C6RA06669K.

62. Manns, D., Nyffenegger, C., Saake, B., and Meyer, A. S. (2016) Brown seaweed processing: enzymatic saccharification of Laminaria digitata requires no pre-treatment, J. Appl. Phycol., 28, 1287-1294, doi: 10.1007/s10811-015-0663-9.