БИОХИМИЯ, 2022, том 87, вып. 4, с. 497–507
УДК 577.25
Определение 2‑оксокислот в экстрактах мозга крыс с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии
1 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991 Москва, Россия
2 Институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Россия
3 Сеченовский университет, кафедра биохимии, 119991 Москва, Россия
4 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, факультет биоинженерии и биоинформатики, 119991 Москва, Россия
Поступила в редакцию 17.03.2022
После доработки 20.03.2022
Принята к публикации 20.03.2022
DOI: 10.31857/S0320972522040030
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ВЭЖХ, 2‑оксокислоты, экстракты мозга крыс, 2,4‑динитрофенилгидразин, валидация метода.
Статья на английском языке опубликована в режиме Open Access (открытого доступа) на сайте издательства Springer. DOI: 10.1134/S0006297922040058.
Аннотация
2-Оксокислоты принимают участие в ряде важнейших метаболических процессов, в связи с этим они могут быть использованы как биомаркеры для диагностики болезней человека. С учетом опубликованных методов и известных проблем определения содержания 2‑оксокислот в тканях млекопитающих нами был разработан оптимизированный метод высокоэффективной жидкостной хроматографии 2,4‑динитрофенилгидразиновых производных 2‑оксокислот. Ввиду своей химической устойчивости 2,4‑динитрофенилгидразиновые производные 2‑оксокислот обладают рядом преимуществ по сравнению с ранее использовавшимися производными фенилгидразина. В работе определено содержание пирувата, глиоксилата, 2‑оксоглутарата, 2‑оксомалоната и 4‑метилтио-2‑оксобутирата в метанол-уксусных экстрактах мозга крыс, обсуждены вопросы пробоподготовки при проведении анализов экстрактов мозга млекопитающих. Представленные валидационные характеристики метода демонстрируют, что предел количественного определения достигает 2 нмоль/г ткани для каждой из пяти 2‑оксокислот. Разработанный метод позволяет исследовать тонкие изменения содержания 2‑оксокислот как (пато)физиологических индикаторов метаболизма в тканях млекопитающих.
Текст статьи
Сноски
* Адресат для корреспонденции.
Финансирование
Работа поддержана грантом РНФ № 18‑14‑00116 (руководитель В.И. Буник).
Благодарности
Авторы выражают благодарность А.В. Граф (НИИ физико-химической биологии и биологический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова) за предоставленные образцы коры головного мозга крыс.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Соблюдение этических норм
Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или использованием животных в качестве объектов.
Список литературы
1. Graham, D. E. (2011) 2-oxoacid metabolism in methanogenic CoM and CoB biosynthesis, Methods Enzymol., 494, 301-326, doi: 10.1016/B978-0-12-385112-3.00015-9.
2. Muhling, J., Paddenberg, R., Hempelmann, G., and Kummer, W. (2006) Hypobaric hypoxia affects endogenous levels of alpha-keto acids in murine heart ventricles, Biochem. Biophys. Res. Commun., 342, 935-939, doi: 10.1016/j.bbrc.2006.02.054.
3. Hutson, S. M., and Harper, A. E. (1981) Blood and tissue branched-chain amino and alpha-keto acid concentrations: Effect of diet, starvation, and disease, Am. J. Clin. Nutr., 34, 173-183, doi: 10.1093/ajcn/34.2.173.
4. Hoang, M., and Joseph, J. W. (2020) The role of alpha-ketoglutarate and the hypoxia sensing pathway in the regulation of pancreatic beta-cell function, Islets, 12, 108-119, doi: 10.1080/19382014.2020.1802183.
5. Kronberger, L., Semmelrock, H. J., Schaur, R. J., Schauenstein, E., Schreibmayer, W., et al. (1980) Tumor host relations. VI. Is alpha-ketoglutarate a tumor marker? Association with tumor extent in humans – correlation with tumor size in rats, J. Cancer Res. Clin. Oncol., 97, 295-299, doi: 10.1007/BF00405781.
6. Shibata, K., Nakata, C., and Fukuwatari, T. (2016) High-performance liquid chromatographic method for profiling 2-oxo acids in urine and its application in evaluating vitamin status in rats, Biosci. Biotechnol. Biochem., 80, 304-312, doi: 10.1080/09168451.2015.1083395.
7. Bertrand, M., Decoville, M., Meudal, H., Birman, S., and Landon, C. (2020) Metabolomic nuclear magnetic resonance studies at presymptomatic and symptomatic stages of Huntington’s disease on a Drosophila model, J. Proteome Res., 19, 4034-4045, doi: 10.1021/acs.jproteome.0c00335.
8. Kondoh, H., Teruya, T., and Yanagida, M. (2020) Metabolomics of human fasting: new insights about old questions, Open Biol., 10, 200176, doi: 10.1098/rsob.200176.
9. Losman, J. A., Koivunen, P., and Kaelin, W. G., Jr. (2020) 2-Oxoglutarate-dependent dioxygenases in cancer, Nat. Rev. Cancer, 20, 710-726, doi: 10.1038/s41568-020-00303-3.
10. Petrarulo, M., Pellegrino, S., Bianco, O., Marangella, M., Linari, F., et al. (1988) High-performance liquid chromatographic determination of glyoxylic acid in urine, J. Chromatography, 432, 37-46, doi: 10.1016/s0378-4347(00)80631-3.
11. Lange, M., and Malyusz, M. (1994) Fast method for the simultaneous determination of 2-oxo acids in biological fluids by high-performance liquid chromatography, J. Chromatography. B Biomed. Appl., 662, 97-102, doi: 10.1016/0378-4347(94)00383-1.
12. Tonhazy, N. E., White, N. G., and Umbreit, W. W. (1950) A rapid method for the estimation of the glutamic-aspartic transaminase in tissues and its application to radiation sickness, Arch. Biochem., 28, 36-42.
13. Reitman, S., and Frankel, S. (1957) A colorimetric method for the determination of serum glutamic oxalacetic and glutamic pyruvic transaminases, Am. J. Clin. Pathol., 28, 56-63, doi: 10.1093/ajcp/28.1.56.
14. De Ochs, S. M., Fasciotti, M., Barreto, R. P., de Figueiredo, N. G., Albuquerque, F. C., et al. (2010) Optimization and comparison of HPLC and RRLC conditions for the analysis of carbonyl-DNPH derivatives, Talanta, 81, 521-529, doi: 10.1016/j.talanta.2009.12.036.
15. Wahed, P., Razzaq, M. A., Dharmapuri, S., and Corrales, M. (2016) Determination of formaldehyde in food and feed by an in-house validated HPLC method, Food Chem., 202, 476-483, doi: 10.1016/j.foodchem.2016.01.136.
16. Singh, B. K., Szamosi, I., and Shaner, D. (1993) A high-performance liquid chromatography assay for threonine/serine dehydratase, Anal. Biochem., 208, 260-263, doi: 10.1006/abio.1993.1043.
17. Hayashi, T., Tsuchiya, H., Todoriki, H., and Naruse, H. (1982) High-performance liquid chromatographic determination of alpha-keto acids in human urine and plasma, Anal. Biochem., 122, 173-179, doi: 10.1016/0003-2697(82)90267-6.
18. Martis, S., Droux, B. M., Deboudard, F., Nasser, W., Meyer, S., et al. (2020) Separation and quantification of 2-Keto-3-deoxy-gluconate (KDG) a major metabolite in pectin and alginate degradation pathways, Anal. Biochem., 619, 114061, doi: 10.1016/j.ab.2020.114061.
19. Marangella, M., Petrarulo, M., Bianco, O., Vitale, C., Finocchiaro, P., et al. (1991) Glycolate determination detects type I primary hyperoxaluria in dialysis patients, Kidney Int., 39, 149-154, doi: 10.1038/ki.1991.19.
20. Ksenofontov, A. L., Boyko, A. I., Mkrtchyan, G. V., Tashlitsky, V. N., Timofeeva, A. V., et al. (2017) Analysis of free amino acids in mammalian brain extracts, Biochemistry (Moscow), 82, 1183-1192, doi: 10.1134/S000629791710011X.
21. Trоfimova, L., Ksenofontov, A., Mkrtchyan, G., Graf, A., Baratova, L., et al. (2016) Quantification of rat brain amino acids, Anal. Data Consistency, 12, 349-356, doi: 10.2174/1573411011666151006220356.
22. Artiukhov, A. V., Kazantsev, A. V., Lukashev, N. V., Bellinzoni, M., and Bunik, V. I. (2020) Selective inhibition of 2-oxoglutarate and 2-oxoadipate dehydrogenases by the phosphonate analogs of their 2-oxo acid substrates, Front. Chem., 8, 596187, doi: 10.3389/fchem.2020.596187.
23. Bligh, E. G., and Dyer, W. J. (1959) A rapid method of total lipid extraction and purification, Can. J. Biochem. Physiol., 37, 911-917, doi: 10.1139/o59-099.
24. Trofimova, L. K., Araujo, W. L., Strokina, A. A., Fernie, A. R., Bettendorff, L., et al. (2012) Consequences of the alpha-ketoglutarate dehydrogenase inhibition for neuronal metabolism and survival: Implications for neurodegenerative diseases, Curr. Med. Chem., 19, 5895-5906, doi: 10.2174/092986712804143367.
25. Schenker, S., McCandless, D. W., Brophy, E., and Lewis, M. S. (1967) Studies on the intracerebral toxicity of ammonia, J. Clin. Invest., 46, 838-848, doi: 10.1172/JCI105583.
26. Dale, R. A. (1965) Effects of sampling procedures on the contents of some intermediate metabolities of glycolysis in rat tissues, J. Physiol., 181, 701-711, doi: 10.1113/jphysiol.1965.sp007792.
27. Miller, A. L., Hawkins, R. A., Harris, R. L., and Veech, R. L. (1972) The effects of acute and chronic morphine treatment and of morphine withdrawal on rat brain in vivo, Biochem. J., 129, 463-469, doi: 10.1042/bj1290463.
28. Goldberg, N. D., Passonneau, J. V., and Lowry, O. H. (1966) Effects of changes in brain metabolism on the levels of citric acid cycle intermediates, J. Biol. Chem., 241, 3997-4003.
29. Holowach, J., Kauffman, F., Ikossi, M. G., Thomas, C., and McDougal, D. B., Jr. (1968) The effects of a thiamine antagonist, pyrithiamine, on levels of selected metabolic intermediates and on activities of thiamine-dependent enzymes in brain and liver, J. Neurochem., 15, 621-631, doi: 10.1111/j.1471-4159.1968.tb08961.x.
30. Gardiner, M., Smith, M. L., Kagstrom, E., Shohami, E., and Siesjo, B. K. (1982) Influence of blood glucose concentration on brain lactate accumulation during severe hypoxia and subsequent recovery of brain energy metabolism, J. Cereb. Blood Flow Metab., 2, 429-438, doi: 10.1038/jcbfm.1982.49.
31. Folbergrova, J., MacMillan, V., and Siesjo, B. K. (1972) The effect of hypercapnic acidosis upon some glycolytic and Krebs cycle-associated intermediates in the rat brain, J. Neurochem., 19, 2507-2517, doi: 10.1111/j.1471-4159.1972.tb01310.x.
32. Thurston, J. H., Hauhart, R. E., and Schiro, J. A. (1983) Lactate reverses insulin-induced hypoglycemic stupor in suckling-weanling mice: Biochemical correlates in blood, liver, and brain, J. Cereb. Blood Flow Metab., 3, 498-506, doi: 10.1038/jcbfm.1983.77.
33. Soto, M., Orliaguet, L., Reyzer, M. L., Manier, M. L., Caprioli, R. M., et al. (2018) Pyruvate induces torpor in obese mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 115, 810-815, doi: 10.1073/pnas.1717507115.
34. Liang, C. C. (1962) Studies on experimental thiamine deficiency. Trends of keto acid formtion and detection of glyoxylic acid, Biochem. J., 82, 429-434, doi: 10.1042/bj0820429.
35. Schadewaldt, P., Hummel, W., Trautvetter, U., and Wendel, U. (1989) A convenient enzymatic method for the determination of 4-methyl-2-oxopentanoate in plasma: Comparison with high performance liquid chromatographic analysis, Clin. Chim. Acta, 183, 171-182, doi: 10.1016/0009-8981(89)90333-1.
36. Wendel, U., Even, G., Langenbeck, U., Schadewaldt, P., and Hummel, W. (1992) Determination of (S)- and (R)-2-oxo-3-methylvaleric acid in plasma of patients with maple syrup urine disease, Clin. Chim. Acta, 208, 85-91, doi: 10.1016/0009-8981(92)90024-k.
37. Blom, H. J., Ferenci, P., Grimm, G., Yap, S. H., and Tangerman, A. (1991) The role of methanethiol in the pathogenesis of hepatic encephalopathy, Hepatology, 13, 445-454.
38. Wiese, E. K., Hitosugi, S., Buhrow, S. A., Loa, S. T., Sreedhar, A., et al. (2020) Reductive amination of alpha-Ketoglutarate in metabolite extracts results in glutamate overestimation, J. Chromatogr. A, 1623, 461169, doi: 10.1016/j.chroma.2020.461169.
39. Arieff, A. I., Massry, S. G., Barrientos, A., and Kleeman, C. R. (1973) Brain water and electrolyte metabolism in uremia: Effects of slow and rapid hemodialysis, Kidney Int., 4, 177-187, doi: 10.1038/ki.1973.100.
40. Bunik, V. (2017) Vitamin-Dependent Multienzyme Complexes of 2-Oxo Acid Dehydrogenases: Structure, Function, Regulation and Medical Implications, Nova Science Publisher.