Препаративное получение и очистка рекомбинантного циклофилина А человека

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина» Министерства здравоохранения России, 115478 Москва, Россия

2 Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», 142279 п. Оболенск, Московская обл., Россия

3 Открытое акционерное общество «Институт инженерной иммунологии», 142380 п. Любучаны, Московская обл., Россия

Поступила в редакцию 26.01.2022
После доработки 15.02.2022
Принята к публикации 15.02.2022

DOI: 10.31857/S032097252203006X

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: циклофилин А, оптимизация гена, штамм-продуцент, изомеразная активность, хемокиновая активность.

Аннотация

Данное исследование посвящено разработке метода получения препаративного количества рекомбинантного циклофилина А человека (рчЦфА) из Escherichia coli. С тотальной мРНК Т‑клеточной лимфомы человека Jurkat методом ПЦР с обратной транскрипцией амплифицировали полноразмерную кДНК, кодирующую ген ЦфА человека (CYPA). Далее провели оптимизацию нуклеотидной последовательности гена CYPA для обеспечения его высокоэффективной трансляции в E. coli. Рекомбинантную ДНК CYPA клонировали в вектор pET22b(+) и полученную экспрессионную плазмиду использовали для трансформации бактерий E. coli штамма BL21(DE3)Gold. Рекомбинантный клон-продуцент E. coli обеспечивал синтез рчЦфА в растворимом состоянии в цитоплазме бактерий. Эффективность синтеза рчЦфА составляла до 50% суммарного белка клетки, что позволяло получать рчЦфА в количестве до 1 г с литра культуры. Был отработан метод очистки рчЦфА, состоящий из одноэтапной тандемной анионообменной хроматографии на колонках DEAE- и Q‑Sepharose. Чистота полученного белка составляла 95% по данным электрофореза (SDS‑PAGE), а его контаминация эндотоксином не превышала 0,05 нг на 1 мг белка, что соответствует требованиям Европейской фармакопеи к инъекционным препаратам. Полученный рекомбинантный белок сохранял функциональные свойства нативного ЦфА, такие как изомеразная активность и хемокиновая активность, выявленная по усилению миграции стволовых кроветворных клеток костного мозга мыши in vivo. Полученный штамм E. coli является суперпродуцентом и может быть использован при проведении масштабных лабораторных исследований рчЦфА, а также для доклинических и клинических испытаний данного белка как лекарственного средства.

Текст статьи

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства промышленности и торговли Российской Федерации (грант № 12411.1008799.13.004).

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Список литературы

1. Nigro, P., Pompilio, G., and Capogrossi, M. C. (2013) Cyclophilin A is a key player for human disease, Cell Death Dis., 4, e888, doi: 10.1038/cddis.2013.410.

2. Wang, P., and Heitman, J. (2005) Cyclophilins, Genome Biol., 6, 226, doi: 10.1186/gb-2005-6-7-226.

3. Honga, F., Leeb, J., Piaoa, Y. J., Jae, Y. K., Kim, Y. J., et al. (2004) Transgenic mice overexpressing cyclophilin A are resistant to cyclosporin A-induced nephrotoxicity via peptidyl-prolyl cis–trans isomerase activity, Biochem. Biophys. Res. Commun., 316, 1073-1080, doi: 10.1016/j.bbrc.2004.02.160.

4. Colgan, J., Asmal, M., Neagu, M., Yu, B., Schneidkraut, J., et al. (2004) Cyclophilin A regulates TCR signal strength in CD4⁺ T cells via a proline-directed conformational switch in Itk, Immunity, 21, 189-201, doi: 10.1016/j.immuni.2004.07.005.

5. Arora, K., Gwinn, W. M., Bower, M. A., Watson, A., Okwumabua, I., et al. (2005) Extracellular cyclophilins contribute to the regulation of inflammatory responses, J. Immunol., 175, 517-522, doi: 10.4049/jimmunol.175.1.517.

6. Dawar, F. U., Wu, J., Zhao, L., Khattak, M. N. K, Mei, J., et al. (2017) Updates in understanding the role of cyclophilin A in leukocyte chemotaxis, J. Leukoc Biol., 101, 823-826, doi: 10.1189/jlb.3RU1116-477R.

7. Kalinina, A. A., Silaeva, Yu. Yu., Kazansky, D. B., and Khromykh, L. M. (2019) The role of recombinant human cyclophilin A in the antitumor immune response, Acta Naturae, 11, 63-67, doi: 10.32607/20758251-2019-11-2-63-67.

8. Ramachandran, S., Venugopal, A., Kutty, V., Vinitha, A., Divya, G., et al. (2014) Plasma level of cyclophilin A is increased in patients with type 2 diabetes mellitus and suggests presence of vascular disease, Cardiovasc. Diabetol., 13, 38, doi: 10.1186/1475-2840-13-38.

9. Kalinina, A., Golubeva, I., Kudryavtsev, I., Khromova, N., Antoshina, E., et al. (2021) Cyclophilin A is a factor of antitumor defense in the early stages of tumor development, Int. Immunopharmacol., 94, 107470, doi: 10.1016/j.intimp.2021.107470.

10. Spik, G., Haendler, B., Delmas, O., Mariller, C., Chamoux, M., et al. (1991) A novel secreted cyclophilin-like protein (SCYLP), J. Biol. Chem., 266, 10735-10738.

11. Khromykh, L. M., Kulikova, N. L., Anfalova, T. V., Muranova, T. A., Abramov, V. M., et al. (2007) Cyclophilin A produced by thymocytes regulates the migration of murine bone marrow cells, Cell Immunol., 249, 46-53, doi: 10.1016/j.cellimm.2007.11.002.

12. Perrucci, G., Straino, S., Corliano, M., Scopece, A., Napolitano, M., et al. (2016) Cyclophilin A modulates bone marrow-derived CD117(+) cells and enhances ischemia-induced angiogenesis via the SDF-1/CXCR4 axis, Int. J. Cardiol., 212, 324-335, doi: 10.1016/j.ijcard.2016.03.082.

13. Hong, F., Lee, J., Song, J., Lee, S., Ahn, H., et al. (2002) Cyclosporin A blocks muscle differentiation by inducing oxidative stress and inhibiting the peptidyl-prolyl-cis–trans isomerase activity of cyclophilin A: cyclophilin A protects myoblasts from cyclosporin A-induced cytotoxicity, FASEB J., 16, 1633-1635, doi: 10.1096/fj.02-0060fje.

14. Guo, M., James, A., Kwak, J., Shen, J., Yokoyama, K., et al. (2016) Cyclophilin A (CypA) plays dual roles in regulation of bone anabolism and resorption, Sci. Rep., 6, 22378, doi: 10.1038/srep22378.

15. Liu, X., Zhao, Z., Xu, C., Sun, L., Chen, J., et al. (2012) Cyclophilin A restricts influenza A virus replication through degradation of the M1 protein, PLoS One, 7, e31063, doi: 10.1371/journal.pone.0031063.

16. Malyala, P., and Singh, M. (2008) Endotoxin limits in formulations for preclinical research, J. Pharm. Sci., 97, 2041-2044, doi: 10.1002/jps.21152.

17. Khromykh, L. M., Kalinina, A. A., Kozyr, A. V., Kolesnikov, A. V., Silaeva, Yu. Yu., et al. (2016) The strain of Escherichia coli BL21(DE3)goldpETCYPopti is the producer of recombinant human cyclophilin A. Patent # 2603283, Russian Federation.

18. Wu, X., Jörnvall, H., Berndt, K. D., and Oppermann, U. (2004) Codon optimization reveals critical factors for high level expression of two rare codon genes in Escherichia coli: RNA stability and secondary structure but not tRNA abundance, Biochem. Biophys. Res. Commun., 313, 89-96, doi: 10.1016/j.bbrc.2003.11.091.

19. Li, G. W., Oh, E., and Weissman, J. S. (2012) The anti-Shine–Dalgarno sequence drives translational pausing and codon choice in bacteria, Nature, 484, 538-541, doi: 10.1038/nature10965.

20. Jin, H., Zhao, Q., Gonzalez de Valdivia, E. I., Ardell, D. H., Stenström, M., et al. (2006) Influences on gene expression in vivo by a Shine–Dalgarno sequence, Mol. Microbiol., 60, 480-492, doi: 10.1111/j.1365-2958.2006.05110.x.

21. Studier, F. W., and Moffattm, B. A. (1986) Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, J. Mol. Biol., 189, 113-130, doi: 10.1016/0022-2836(86)90385-2.

22. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685, doi: 10.1038/227680a0.

23. Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 72, 248-254, doi: 10.1006/abio.1976.9999.

24. Kumawat, M., Karuna, I., Ahlawat, N., and Ahlawat, S. (2020) Identification of Salmonella typhimurium peptidyl-prolyl cis–trans isomerase B (PPIase B) and assessment of their role in the protein folding protein, Pept. Lett., 27, 744-750, doi: 10.2174/0929866527666200225124104.

25. Till, J. E., and McCullough, E. A. (1961) A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, Radiat. Res., 14, 213-222, doi: 10.1667/rrav01.1.

26. Liu, J., Albers, M. W., Chen, C. M., Schreiber, S. L., and Walsh, C. T. (1990) Cloning, expression, and purification of human cyclophilin in Escherichia coli and assessment of the catalytic role of cysteines by site-directed mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2304-2308, doi: 10.1073/pnas.87.6.2304.

27. Grosjean, H., and Fiers, W. (1982) Preferential codon usage in prokaryotic genes: the optimal codon–anticodon interaction energy and the selective codon usage in efficiently expressed genes, Gene, 18, 199-209, doi: 10.1016/0378-1119(82)90157-3.

28. Hatfield, G. W., and Roth, D. A. (2007) Optimizing scaleup yield for protein production: computationally optimized DNA assembly (CODA) and translation engineering, Biotechnol. Annu. Rev., 13, 27-42, doi: 10.1016/S1387-2656(07)13002-7.

29. Jestin, J. L., and Kempf, A. (2009) Optimization models and the structure of the genetic code, J. Mol. Evol., 69, 452-457, doi: 10.1007/s00239-009-9287-5.

30. Sambrook, J., and Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y.

31. Handschumacher, R. E., Harding, M. W., Rice, J., Drugge, R. J., and Speicher, D. W. (1984) Cyclophilin: A specific cytosolic binding protein for cyclosporin A, Science, 226, 544-547, doi: 10.1126/science.6238408.

32. Khromykh, L. M., Lazarev, V. N., Manuvera, V. A., Kalinina, A. A., Silaeva, Yu. Yu., et al. (2015) The strain of Escherichia coli BL21(DE3)gold/pETmin-CypA is the producer of recombinant human cyclophilin A. Patent #2557305, Russian Federation.

33. Kalinina, A., Zamkova, M., Antoshina, E., Trukhanova, L., Gorkova, T., et al. (2019) Analyses of the toxic properties of recombinant human cyclophilin A in mice, J. Immunotoxicol., 16, 182-190, doi: 10.1080/1547691X.2019.1665597.