БИОХИМИЯ, 2021, том 86, вып. 7, с. 996–1005
УДК 57.085.23
Получение трансгенных эмбриональных стволовых клеток крысы с использованием системы CRISPR/Cpf1 для индуцируемого нокаута генов
Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090 Новосибирск, Россия
Поступила в редакцию 23.03.2021
После доработки 09.05.2021
Принята к публикации 10.05.2021
DOI: 10.31857/S0320972521070046
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: эмбриональные стволовые клетки, крыса, CRISPR/Cas, редактирование генома, Cre-рекомбиназа.
Аннотация
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) крысы играют важную роль в изучении генов, участвующих в поддержании плюрипотентного состояния и в процессах раннего развития этого модельного организма. Для изучения функций жизненно важных генов, а также в ходе процессов дифференцировки клеток широко используется метод индуцируемого нокаута. Система CreERT2/loxP позволяет получить индуцируемый нокаут в клетках, экспрессирующих тамоксифен-зависимую Cre-рекомбиназу (CreERT2) и содержащих loxP-сайты, фланкирующие целевой ген, путём добавления в культуральную среду 4-гидрокситамоксифена. Однако в настоящее время отсутствуют линии ЭСК крысы, экспрессирующие CreERT2. В данной работе мы протестировали три CRISPR/Cas-системы на предмет внесения двуцепочечных разрывов в локус Rosa26 в ЭСК крысы и произвели встройку в данный локус тамоксифен-зависимой Cre-рекомбиназы с использованием системы CRISPR/Cpf1. Было показано, что полученные трансгенные линии ЭСК крысы сохранили характеристики плюрипотентных клеток. Активность тамоксифен-зависимой Cre-рекомбиназы была проанализирована с использованием репортёрного вектора.
Текст статьи
Сноски
* Адресат для корреспонденции.
Финансирование
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 19-74-00022).
Благодарности
Авторы выражают благодарность Шевченко Александру Игоревичу и Захаровой Ирине Сергеевне за помощь в спонтанной дифференцировке и иммунофлуоресцентном окрашивании, Медведеву Сергею Петровичу за сборку плазмиды pAsCpf1-2NLS, а также ЦКП «Геномика» СО РАН за анализ реакций секвенирования по Сэнгеру.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Соблюдение этических норм
Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.
Список литературы
1. Evans, M. J., and Kaufman, M. H. (1981) Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos, Nature, 292, 154-156.
2. Martin, G. R. (1981) Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634-7638, doi: 10.1073/pnas.78.12.7634.
3. Smith, J. R., Bolton, E. R., and Dwinell, M. R. (2019) The rat: a model used in biomedical research, Methods Mol. Biol., 2018, 1-41, doi: 10.1007/978-1-4939-9581-3_1.
4. Buehr, M., Meek, S., Blair, K., Yang, J., Ure, J., et al. (2008) Capture of authentic embryonic stem cells from rat blastocysts, Cell, 135, 1287-1298, doi: 10.1016/j.cell.2008.12.007.
5. Li, P., Tong, C., Mehrian-Shai, R., Jia, L., Wu, N., et al. (2008) Germline competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts, Cell, 135, 1299-1310, doi: 10.1016/j.cell.2008.12.006.
6. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., and Charpentier, E. (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity, Science, 337, 816-821, doi: 10.1126/science.1225829.
7. Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., and Chambon, P. (1997) Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains, Biochem. Biophys. Res. Commun., 237, 752-757, doi: 10.1006/bbrc.1997.7124.
8. Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Iranzo, J., Shmakov, S. A., Alkhnbashi, O. S., et al. (2020) Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants, Nat. Rev. Microbiol., 18, 67-83, doi: 10.1038/s41579-019-0299-x.
9. Ran, F. A., Cong, L., Yan, W. X., Scott, D. A., Gootenberg, J. S., et al. (2015) In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9, Nature, 520, 186-191, doi: 10.1038/nature14299.
10. Zetsche, B., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Slaymaker, I. M., Makarova, K. S., et al. (2015) Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system, Cell, 163, 759-771, doi: 10.1016/j.cell.2015.09.038.
11. Chen, Y., Spitzer, S., Agathou, S., Karadottir, R. T., and Smith, A. (2017) Gene editing in rat embryonic stem cells to produce in vitro models and in vivo reporters, Stem Cell Rep., 9, 1262-1274, doi: 10.1016/j.stemcr.2017.09.005.
12. Kobayashi, T., Kobayashi, H., Goto, T., Takashima, T., Oikawa, M., et al. (2020) Germline development in rat revealed by visualization and deletion of Prdm14, Development, 147, doi: 10.1242/dev.183798.
13. Li, W., Li, X., Li, T., Jiang, M. G., Wan, H., Luo, G. Z., et al. (2014) Genetic modification and screening in rat using haploid embryonic stem cells, Cell Stem Cell, 14, 404-414, doi: 10.1016/j.stem.2013.11.016.
14. Yamamoto, S., Ooshima, Y., Nakata, M., Yano, T., Nishimura, N., et al. (2015) Efficient gene-targeting in rat embryonic stem cells by CRISPR/Cas and generation of human kynurenine aminotransferase II (KAT II) knock-in rat, Transgen. Res., 24, 991-1001, doi: 10.1007/s11248-015-9909-1.
15. Sherstyuk, V. V., Medvedev, S. P., Elisaphenko, E. A., Vaskova, E. A., Ri, M T., et al. (2017) Genome-wide profiling and differential expression of microRNA in rat pluripotent stem cells, Sci. Rep., 7, 2787, doi: 10.1038/s41598-017-02632-0.
16. Sherstyuk, V. V., Yanshole, L. V., Zelentsova, E. A., Melnikov, A. D., Medvedev, S. P., et al. (2020) Comparative metabolomic profiling of rat embryonic and induced pluripotent stem cells, Stem Cell Rev. Rep., 16, 1256-1265, doi: 10.1007/s12015-020-10052-3.
17. Vaskova, E. A., Medvedev, S. P., Sorokina, A. E., Nemudryy, A. A., Elisaphenko, E. A., et al. (2015) Transcriptome characteristics and X-chromosome inactivation status in cultured rat pluripotent stem cells, Stem Cells Dev., 24, 2912-2924, doi: 10.1089/scd.2015.0204.
18. Sladitschek, H. L., and Neveu, P. A. (2015) MXS-chaining: a highly efficient cloning platform for imaging and flow cytometry approaches in mammalian systems, PLoS One, 10, e0124958, doi: 10.1371/journal.pone.0124958.
19. DeKelver, R. C., Choi, V. M., Moehle, E. A., Paschon, D. E., Hockemeyer, D., et al. (2010) Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome, Genome Res., 20, 1133-1142, doi: 10.1101/gr.106773.110.
20. Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., et al. (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems, Science, 339, 819-823, doi: 10.1126/science.1231143.
21. Swiech, L., Heidenreich, M., Banerjee, A., Habib, N., Li, Y., et al. (2015) In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9, Nat. Biotechnol., 33, 102-106, doi: 10.1038/nbt.3055.
22. Toth, E., Czene, B. C., Kulcsar, P. I., Krausz, S. L., Talas, A., et al. (2018) Mb- and FnCpf1 nucleases are active in mammalian cells: activities and PAM preferences of four wild-type Cpf1 nucleases and of their altered PAM specificity variants, Nucleic Acids Res., 46, 10272-10285, doi: 10.1093/nar/gky815.
23. Gao, L., Cox, D. B. T., Yan, W. X., Manteiga, J. C., Schneider, M. W., et al. (2017) Engineered Cpf1 variants with altered PAM specificities, Nat. Biotechnol., 35, 789-792, doi: 10.1038/nbt.3900.
24. Park, J., Bae, S., and Kim, J. S. (2015) Cas-Designer: a web-based tool for choice of CRISPR-Cas9 target sites, Bioinformatics, 31, 4014-4016, doi: 10.1093/bioinformatics/btv537.
25. Vaskova, E. A., Dementyeva, E. V., Shevchenko, A. I., Pavlova, S. V., Grigor’eva, E. V., et al. (2014) Dynamics of the two heterochromatin types during imprinted X chromosome inactivation in vole Microtus levis, PLoS One, 9, e88256, doi: 10.1371/journal.pone.0088256.
26. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., and van Steensel, B. (2014) Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition, Nucleic Acids Res., 42, e168, doi: 10.1093/nar/gku936.
27. Kim, D., Kim, J., Hur, J. K., Been, K. W., Yoon, S. H., and Kim, J. S. (2016) Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells, Nat. Biotechnol., 34, 863-868, doi: 10.1038/nbt.3609.
28. Kleinstiver, B. P., Tsai, S. Q., Prew, M. S., Nguyen, N. T., Welch, M. M., et al. (2016) Genome-wide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases in human cells, Nat. Biotechnol., 34, 869-874, doi: 10.1038/nbt.3620.
29. Kaczmarczyk, S. J., and Green, J. E. (2001) A single vector containing modified Cre recombinase and LOX recombination sequences for inducible tissue-specific amplification of gene expression, Nucleic Acids Res., 29, E56-56, doi: 10.1093/nar/29.12.e56.
30. Blair, K., Leitch, H. G., Mansfield, W., Dumeau, C. E., Humphreys, P., and Smith, A. G. (2012) Culture parameters for stable expansion, genetic modification and germline transmission of rat pluripotent stem cells, Biol. Open, 1, 58-65, doi: 10.1242/bio.2011029.
31. Kobayashi, T., Kato-Itoh, M., Yamaguchi, T., Tamura, C., Sanbo, M., et al. (2012) Identification of rat Rosa26 locus enables generation of knock-in rat lines ubiquitously expressing tdTomato, Stem Cells Dev., 21, 2981-2986, doi: 10.1089/scd.2012.0065.
32. Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., and Ying, Q. L. (2010) Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells, Nature, 467, 211-213, doi: 10.1038/nature09368.
33. Fu, Y., Foden, J. A., Khayter, C., Maeder, M. L., Reyon, D., et al. (2013) High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells, Nat. Biotechnol., 31, 822-826, doi: 10.1038/nbt.2623.
34. Pattanayak, V., Lin, S., Guilinger, J. P., Ma, E., Doudna, J. A., and Liu, D. R. (2013) High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity, Nat. Biotechnol., 31, 839-843, doi: 10.1038/nbt.2673.
35. Gonzalez, F., Zhu, Z., Shi, Z. D., Lelli, K., Verma, N., et al. (2014) An iCRISPR platform for rapid, multiplexable, and inducible genome editing in human pluripotent stem cells, Cell Stem Cell, 15, 215-226, doi: 10.1016/j.stem.2014.05.018.
36. Wu, M., Liu, S., Gao, Y., Bai, H., Machairaki, V., et al. (2018) Conditional gene knockout and reconstitution in human iPSCs with an inducible Cas9 system, Stem Cell Res., 29, 6-14, doi: 10.1016/j.scr.2018.03.003.
37. Flemr, M., and Buhler, M. (2015) Single-step generation of conditional knockout mouse embryonic stem cells, Cell Rep., 12, 709-716, doi: 10.1016/j.celrep.2015.06.051.
38. Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., and Kuhn, R. (2011) Generating conditional knockout mice, Methods Mol. Biol., 693, 205-231, doi: 10.1007/978-1-60761-974-1_12.