БИОХИМИЯ, 2021, том 86, вып. 4, с. 483–495

УДК 577.12

Канальная активность родопсинов может быть выявлена при измерении потенциал-зависимости фототоков на плоских бислойных липидных мембранах

© 2021 Т.И. Рокицкая 1*, Н. Маляр 2, К.В. Ковалев 2,3, А.А. Волков 4,5, В.И. Горделий 2,3,4,5, Ю.Н. Антоненко 1

НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Россия; электронная почта: rokitskaya@genebee.msu.ru

Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет), 141701 Долгопрудный, Московская обл., Россия

Университет Гренобль–Альпы, CEA, CNRS, Институт структурной биологии (IBS), 38044 Гренобль, Франция

Юлихский исследовательский центр, Институт биологической обработки информации. Структурная биохимия (IBI-7), 52425 Юлих, Германия

Юлихский исследовательский центр, Центр структурной биологии Юлиха (JuStruct), 52425 Юлих, Германия

Поступила в редакцию 04.12.2020
После доработки 22.01.2021
Принята к публикации 22.01.2021

DOI: 10.31857/S0320972521040035

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ретиналь-содержащие белки, канальный родопсин, протонная помпа, протеолипосомы, бислойная липидная мембрана, протонофор.

Аннотация

Определение функциональных свойств ретиналь-содержащих белков зачастую включает исследования на модельных системах, например, измерения электрического тока через плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ) с адсорбированными на одной поверхности мембраны протеолипосомами. Однако возможности этого метода до конца не изучены. На примере двух светочувствительных белков – бактериородопсина (bR) и канального родопсина 2 (ChR2) – мы показали, что потенциал-зависимости стационарных фототоков в присутствии протонофора имеют сильно отличающиеся характеристики. В случае протонной помпы bR регистрируемый через БЛМ фототок не меняет направление при изменении знака прикладываемых напряжений, а для светочувствительного белка канального типа ChR2 характерны увеличение фототока с ростом напряжения и смена знака тока при переходе через нулевые значения напряжения. В работе также показано, что для регистрации максимальных стационарных фототоков лучше всего подходит протонофор 4,5,6,7-тетрахлоро-2-трифлуорометил бензимидазол (ТТФБ). При использовании карбонилцианид-m-хлорофенилгидразона (ХКФ) измеряемые фототоки для bR значительно меньше по амплитуде, а для ChR2 – практически равны нулю. Это различие между ТТФБ и ХКФ, по-видимому, связано с тем, что ХКФ, в отличие от ТТФБ, обладает большей скоростью переноса протонов через липосомальные мембраны, чем через декан-содержащие БЛМ, которые используются в качестве поверхности адсорбции протеолипосом.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (грант № 19-04-00238), Российского Фонда Фундаментальных Исследований и Национального центра научных исследований в рамках научного проекта № 19-52-15017, а также при поддержке Государственного задания РФ (соглашение № 075-00337-20-03, проект FSMG-2020-0003).

Благодарности

Выражаем благодарность Christian Baeken за предоставление пурпурных мембран.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или использованием животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Oesterhelt, D., and Stoeckenius, W. (1973) Functions of a new photoreceptor membrane, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 2853-2857.

2. Kayushin, L. P., and Skulachev, V. P. (1974) Bacteriorhodopsin as an electrogenic proton pump: reconstitution of bacteriorhodopsin proteoliposomes generating delta psi and delta pH, FEBS Lett., 39, 39-42.

3. Oesterhelt, D., and Schuhmann, L. (1974) Reconstitution of bacteriorhodopsin, FEBS Lett., 44, 262-265.

4. Drachev, L. A., Jasaitis, A. A., Kaulen, A. D., Kondrashin, A. A., Liberman, E. A., et al. (1974) Direct measurement of electric current generation by cytochrome oxidase, H+-ATPase and bacteriorhodopsin, Nature, 249, 321-324.

5. Drachev, L. A., Frolov, V. N., Kaulen, A. D., Liberman, E. A., Ostroumov, S. A., et al. (1976) Reconstitution of biological molecular generators of electric current. Bacteriorhodopsin, J. Biol. Chem., 251, 7059-7065.

6. Siletsky, S. A., Mamedov, M. D., Lukashev, E. P., Balashov, S. P., Dolgikh, D. A., et al. (2019) Elimination of proton donor strongly affects directionality and efficiency of proton transport in ESR, a light-driven proton pump from Exiguobacterium sibiricum, Biochim. Biophys. Acta Bioenerg., 1860, 1-11.

7. Herrmann, T. R., and Rayfield, G. W. (1978) The electrical response to light of bacteriorhodopsin in planar membranes, Biophys. J., 21, 111-125.

8. Bamberg, E., Dencher, N. A., Fahr, A., and Heyn, M. P. (1981) Transmembranous incorporation of photoelectrically active bacteriorhodopsin in planar lipid bilayers, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7502-7506.

9. Bamberg, E., Apell, H. J., Dencher, N. A., Sperling, W., Stieve, H., and Lauger, P. (1979) Photocurrents generated by bacteriorhodopsin on planar bilayer membranes, Biophys. Struct. Mechanism, 5, 277-292.

10. Bamberg, E., Butt, H. J., Eisenrauch, A., and Fendler, K. (1993) Charge transport of ion pumps on lipid bilayer membranes, Q Rev Biophys., 26, 1-25.

11. Friedrich, T., Geibel, S., Kalmbach, R., Chizhov, I., Ataka, K., et al. (2002) Proteorhodopsin is a light-driven proton pump with variable vectoriality, J. Mol. Biol., 321, 821-838.

12. Nagel, G., Ollig, D., Fuhrmann, M., Kateriya, S., Musti, A. M., et al. (2002) Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae, Science, 296, 2395-2398.

13. Nagel, G., Szellas, T., Huhn, W., Kateriya, S., Adeishvili, N., et al. (2003) Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 13940-13945.

14. Deisseroth, K. (2015) Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience, Nat. Neurosci., 18, 1213-1225.

15. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., and Deisseroth, K. (2005) Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity, Nat. Neurosci., 8, 1263-1268.

16. McIsaac, R. S., Bedbrook, C. N., and Arnold, F. H. (2015) Recent advances in engineering microbial rhodopsins for optogenetics, Curr. Opin. Struct. Biol., 33, 8-15.

17. Sineshchekov, O. A., Govorunova, E. G., Li, H., and Spudich, J. L. (2017) Bacteriorhodopsin-like channelrhodopsins: alternative mechanism for control of cation conductance, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 114, E9512-E9519.

18. Govorunova, E. G., Sineshchekov, O. A., Janz, R., Liu, X., and Spudich, J. L. (2015) Natural light-gated anion channels: a family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics, Science, 349, 647-650.

19. Zabelskii, D., Alekseev, A., Kovalev, K., Rankovic, V., Balandin, T., et al. (2020) Viral rhodopsins 1: a unique family of light-gated ion channels, Nat. Commun., 11, 5707.

20. Gradinaru, V., Zhang, F., Ramakrishnan, C., Mattis, J., Prakash, R., et al. (2010) Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics, Cell, 141, 154-165.

21. Chow, B. Y., Han, X., Dobry, A. S., Qian, X., Chuong, A. S., et al. (2020) High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps, Nature, 463, 98-102.

22. Kovalev, K., Astashkin, R., Gushchin, I., Orekhov, P., Volkov, D., et al. (2020) Molecular mechanism of light-driven sodium pumping, Nat. Commun., 11, 2137.

23. Vogt, A., Silapetere, A., Grimm, C., Heiser, F., Moller, M. A., and Hegemann, P. (2019) Engineered passive potassium conductance in the KR2 sodium pump, Biophys. J., 116, 1941-1951.

24. Kovalev, K., Polovinkin, V., Gushchin, I., Alekseev, A., Shevchenko, V., et al. (2019) Structure and mechanisms of sodium-pumping KR2 rhodopsin, Sci. Adv., 5, eaav2671.

25. Maliar, N., Kovalev, K., Baeken, C., Balandin, T., Astashkin, R., et al. (2020) Crystal structure of the N112A mutant of the light-driven sodium pump KR2, Crystals, 10, 496.

26. Shevchenko, V., Mager, T., Kovalev, K., Polovinkin, V., Alekseev, A., Juettner, J., Chizhov, I., Bamann, C., Vavourakis, C., Ghai, R., Gushchin, I., et al. (2017) Inward H(+) pump xenorhodopsin: mechanism and alternative optogenetic approach, Sci. Adv., 3, e1603187.

27. Gushchin, I., and Gordeliy, V. (2018) Microbial Rhodopsins, Subcell Biochem., 87, 19-56.

28. Bratanov, D., Kovalev, K., Machtens, J. P., Astashkin, R., Chizhov, I., et al. (2019) Unique structure and function of viral rhodopsins, Nat. Commun., 10, 4939.

29. Maliar, N., Okhrimenko, I. S., Petrovskaya, L. E., Alekseev, A. A., Kovalev, K. V., et al. (2020) Novel pH-sensitive microbial rhodopsin from Sphingomonas paucimobilis, Dokl. Biochem. Biophys., 495, 342-346.

30. Feldbauer, K., Zimmermann, D., Pintschovius, V., Spitz, J., Bamann, C., and Bamberg, E. (2009) Channelrhodopsin-2 is a leaky proton pump, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 12317-12322.

31. Geibel, S., Friedrich, T., Ormos, P., Wood, P. G., Nagel, G., and Bamberg, E. (2001) The voltage-dependent proton pumping in bacteriorhodopsin is characterized by optoelectric behavior, Biophys. J., 81, 2059-2068.

32. Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., and Wescott, W. C. (1963) Methods for the formation of single bimolecular lipid membranes in aqueous solution, J. Phys. Chem., 67, 534-535.

33. Volkov, O., Kovalev, K., Polovinkin, V., Borshchevskiy, V., Bamann, C., et al. (2017) Structural insights into ion conduction by channelrhodopsin 2, Science, 358, eaan8862.

34. Dencher, N. A., and Heyn, M. P. (1982) Preparation and properties of monomeric bacteriorhodopsin, Methods Enzymol., 88, 5-10.

35. Chen, Y., Schindler, M., and Simon, S. M. (1999) A mechanism for tamoxifen-mediated inhibition of acidification, J. Biol. Chem., 274, 18364-18373.

36. Gradmann, D., Berndt, A., Schneider, F., and Hegemann, P. (2011) Rectification of the channelrhodopsin early conductance, Biophys. J., 101, 1057-1068.

37. Sineshchekov, O. A., Govorunova, E. G., Wang, J., Li, H., and Spudich, J. L. (2013) Intramolecular proton transfer in channelrhodopsins, Biophys. J., 104, 807-817.

38. Rayfield, G. W. (1982) Kinetics of the light-driven proton movement in model membranes containing bacterio-rhodopsin, Biophys. J., 38, 79-84.

39. Bamberg, E., Hegemann, P., and Oesterhelt, D. (1984) The chromoprotein of halorhodopsin is the light-driven electrogenic chloride pump in Halobacterium halobium, Biochemistry, 23, 6216-6221.

40. Bamberg, E., Hegemann, P., and Oesterhelt, D. (1984) Reconstitution of the light-driven electrogenic ion-pump halorhodopsin in black lipid membranes, Biochim. Biophys. Acta, 773, 53-60.

41. Vodyanoy, I., Vodyanoy, V., and Lanyi, J. K. (1986) Current-voltage characteristics of planar lipid membranes with attached Halobacterium cell-envelope vesicles, Biochim. Biophys. Acta, 858, 92-98.

42. Liberman, E. A., and Topaly, V. P. (1968) Selective transport of ions through bimolecular phospholipid membranes, Biochim. Biophys. Acta, 163, 125-136.

43. Borisova, M. P., Ermishkin, L. N., Liberman, E. A., Silberstein, A. Y., and Trofimov, E. M. (1974) Mechanism of conductivity of bimolecular lipid membranes in the presence of tetrachlorotrifluoromethylbenzimidazole, J. Membr. Biol., 18, 243-261.

44. White, S. H. (1978) Formation of “solvent-free” black lipid bilayer membranes from glyceryl monooleate dispersed in squalene, Biophys. J., 23, 337-347.

45. Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., and Montal, M. (1975) Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers, Biochim. Biophys. Acta, 394, 323-334.

46. Bakker, E. P., van den Heuvel, E. J., Wiechmann, A. H., and van Dam, K. (1973) A comparison between the effectiveness of uncouplers of oxidative phosphorylation in mitochondria and in different artificial membrane systems, Biochim. Biophys. Acta, 292, 78-87.

47. Tittor, J., Schweiger, U., Oesterhelt, D., and Bamberg, E. (1994) Inversion of proton translocation in bacterio-rhodopsin mutants D85N, D85T, and D85,96N, Biophys. J., 67, 1682-1690.

48. Antonenko, Y. N., Khailova, L. S., Rokitskaya, T. I., Nosikova, E. S., Nazarov, P. A., et al. (2019) Mechanism of action of an old antibiotic revisited: role of calcium ions in protonophoric activity of usnic acid, Biochim. Biophys. Acta, 1860, 310-316.