БИОХИМИЯ, 2021, том 86, вып. 2, с. 228–235
УДК 577.152.342
Усиление растворимости и одностадийная очистка функционального димера карбоксипептидазы G2*
1 Department of Biochemistry, Faculty of Biological Sciences, Tarbiat Modares University, 14115 Tehran, Iran
2 Department of Biotechnology, College of Science, University of Tehran, 14155 Tehran, Iran
Поступила в редакцию 02.04.2020
После доработки 22.09.2020
Принята к публикации 13.10.2020
DOI: 10.31857/S032097252102007X
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: карбоксипептидаза G2, интеин, метотрексат.
Аннотация
Карбоксипептидаза G2 (CPG2) является бактериальным ферментом, который катализирует переход метотрексата в его неактивные формы. Далее эти продукты в присутствии высоких доз метотрексата у пациентов с почечными нарушениями выводятся, минуя почки. В связи с возрастающим спросом на этот фермент важно было упростить процесс его продукции. С этой целью в настоящем исследовании проведена попытка выделить и очистить этот ценный фермент, используя интеин-опосредованную очистку с помощью хитин-связывающей аффинной метки. Таким образом, ген CPG2 из Pseudomonas sp. (штамм RS16) был оптимизирован, синтезирован и клонирован в экспрессионный вектор pTXB1. Впоследствии конструкцию трансформировали в штамм BL21 (DE3) Escherichia сoli. Оптимальные условия для его растворимой экспрессии достигались в 2×YT среде, содержащей 1% глюкозу, 0,5 мМ IPTG через 30 ч инкубации при 25 °C. Фермент без интеина экспрессировался в форме инклюзивных телец, что указывает на необходимость интеина для солюбилизации белка. Затем экспрессированный гомодимерный белок очищали до гомогенности с помощью хитиновой аффинной колонки. Для очищенного белка были получены значения Km и kcat 6,5 мкМ и 4,57 с−1 соответственно. Анализ гель-фильтрации показал, что полученный рекомбинантный белок представляет собой димер с молекуляроной массой 83 kDa. Флуоресцентная спектроскопия и метод спектроскопии кругового дихроизма подтвердили наличие у CPG2 третичной и вторичной структур соответственно. Применение интеин-опосредованной системы обеспечило возможность одностадийной очистки CPG2, открыв путь к использованию карбоксипептидазы G2 в фармацевтике.
Текст статьи
Сноски
* Первоначально английский вариант рукописи опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM20-099, 18.01.2021.
** Адресат для корреспонденции.
Финансирование
Работа выполнена при финансовой поддержке Иранского национального института развития медицинских исследований (NIMAD, проект № 940711).
Благодарности
Благодарности. Мы благодарны исследовательскому совету Университета Tarbiat Modares, проф. Khosro Khajeh за поддержку в этом исследовании.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в какой-либо сфере деятельности.
Соблюдение этических норм
Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или использованием животных в качестве объектов.
Список литературы
1. Rowsell, S., Pauptit, R. A., Tucker, A. D., Melton, R. G., Blow, D. M., and Brick, P. (1997) Crystal structure of carboxypeptidase G2, a bacterial enzyme with applications in cancer therapy, Structure, 5, 337-347, doi: 10.1016/S0969-2126(97)00191-3.
2. Goda, S. K., Rashidi, F. A. B., Fakharo, A. A., and Al-Obaidli, A. (2009) Functional overexpression and purification of a codon optimized synthetic glucarpidase (Carboxypeptidase G2) in Escherichia coli, Protein J., 28, 435-442, doi: 10.1016/J.ENZMICTEC.2016.08.001.
3 Ramsey, L. B., Balis, F. M., O’Brien, M. M., Schmiegelow, K., Pauley, J. L., et al. (2018) Consensus guideline for use of glucarpidase in patients with high-dose methotrexate induced acute kidney injury and delayed methotrexate clearance, Oncologist, 23, 52-61.
4. Rattu, M. A., Shah, N., Lee, J. M., Pham, A. Q., and Marzella, N. (2013) Glucarpidase (voraxaze), a carboxypeptidase enzyme for methotrexate toxicity, P T, 38, 732-744.
5. Wingfield, P. T. (2015) Overview of the purification of recombinant proteins, Curr. Protoc. Protein Sci., 80, 6.1.1-6.1.35, doi: 10.1002/0471140864.ps0601s80.
6. Rosano, G. L., and Ceccarelli, E. A. (2014) Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges, Front. Microbiol., 5, 172, doi: 10.3389/fmicb.2014.00172.
7. Goh, H. C., Sobota, R. M., Ghadessy, F. J., and Nirantar, S. (2017) Going native: Complete removal of protein purification affinity tags by simple modification of existing tags and proteases, Protein Expr. Purif., 129, 18-24, doi: 10.1016/J.PEP.2016.09.001.
8. Li, Y. (2011) Self-cleaving fusion tags for recombinant protein production, Biotechnol. Lett., 33, 869-881, doi: 10.1007/s10529-011-0533-8.
9. Fan, Y., Miozzi, J. M., Stimple, S. D., Han, T. C., and Wood, D. W. (2018) Column-free purification methods for recombinant proteins using self-cleaving aggregating tags, Polymers (Basel), 10, 468, doi: 10.3390/polym10050468.
10. Wu, W. Y., Mee, C., Califano, F., Banki, R., and Wood, D. W. (2006) Recombinant protein purification by self-cleaving aggregation tag, Nat. Protoc., 1, 2257-2262, doi: 10.1038/nprot.2006.314.
11. Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., and Pedersen, J. (2006) Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins, Protein Expr. Purif., 48, 1-13, doi: 10.1016/J.PEP.2005.12.002.
12. Belfort, M., Stoddard, B. L., Wood, D. W., and Derbyshire, V. (2006). Homing endonucleases and inteins, Springer Science & Business Media.
13. Banki, R., and Wood, D. W. (2005) Inteins and affinity resin substitutes for protein purification and scale up, Microb. Cell Fact., 4, 1-6, doi: 10.1186/1475-2859-4-32.
14. Lahiry, A., Fan, Y., Stimple, S. D., Raith, M., and Wood, D. W. (2018) Inteins as tools for tagless and traceless protein purification, J. Chem. Technol. Biotechnol., 93, 1827-1835, doi: 10.1002/jctb.5415.
15. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680.
16. Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 72, 248-254.
17. Rashidi, F. B., AlQhatani, A. D., Bashraheel, S. S., Shaabani S., Groves, M. R. et al. (2018) Isolation and molecular characterization of novel glucarpidases: enzymes to improve the antibody directed enzyme pro-drug therapy for cancer treatment, PLoS One, 13, e0196254, doi: 10.1371/journal.pone.0196254.
18. AlQahtani, A. D, Al-Mansoori, L., Bashraheel, S. S., Rashidi, F. B., Al-Yafei, A., et al. (2019) Production of “biobetter” glucarpidase variants to improve drug detoxification and antibody directed enzyme prodrug therapy for cancer treatment, Eur. J. Pharm. Sci., 127, 79-91, doi: 10.1016/J.EJPS.2018.10.014.
19. Wang, L, Kang, J. H., Kim, K. H., and Leeb, E. K. (2009) Expression of intein-tagged fusion protein and its applications in downstream processing, J. Chem. Technol. Biotechnol., 85, 11-18, doi: 10.1002/jctb.2277.
20. Fong, B. A., Wu, W. Y., and Wood, D. W. (2010) The potential role of self-cleaving purification tags in commercial-scale processes, Trends Biotechnol., 28, 272-279, doi: 10.1016/j.tibtech.2010.02.003.
21. Yachnin, B. J., and Khare, S. D. (2017) Engineering carboxypeptidase G2 circular permutations for the design of an autoinhibited enzyme, Protein Eng. Des., 30, 321-331, doi: 10.1093/protein/gzx005.
22. Alishah, K., Asad, S., Khajeh, K., and Akbari, N. (2016) Utilizing intein-mediated protein cleaving for purification of uricase, a multimeric enzyme, Enzyme Microb. Technol., 93-94, 92-98, doi: 10.1016/J.Enzmictec.2016.08.001.
23. Wood, D. W., Derbyshire, V., Wu, W., Chartrain, M., Belfort, M., and Belfort, G. (2000) Optimized single-step affinity purification with a self-cleaving intein applied to human acidic fibroblast growth factor, Biotechnol. Prog., 16, 1055-1063, doi: 10.1021/bp0000858.
24. Sharma, S. S., Chong, S., and Harcum, S. W. (2006) Intein-mediated protein purification of fusion proteins expressed under high-cell density conditions in E. coli, J. Biotechnol., 125, 48-56, doi: 10.1016/j.jbiotec.2006.01.018.
25. Díaz, M., Venturini, E., Marchetti, S., Arenas, G., and Marshall, S. H. (2012) Intein-mediated expression of cecropin in Escherichia coli, Electron. J. Biotechnol., 15, doi: 10.2225/vol15-issue2-fulltext-2.
26. Sherwood, R. F, Melton, R. G., Alwan, S. M., and Hughes, P. (1985) Purification and properties of carboxypeptidase G2 from Pseudomonas sp. strain RS-16, Eur. J. Biochem., 148, 447-453, doi: 10.1111/j.1432-1033.1985.tb08860.x.
27. Minton, N. P., Atkinson, T., and Sherwood, R. F. (1983) Molecular cloning of the Pseudomonas carboxypeptidase G2 gene and its expression in Escherichia coli and Pseudomonas putida, J. Bacteriol., 156, 1222-1227.
28. Jeyaharan, D., Aston, P., Garcia-Perez, A., Schouten, J., Davis, P., and Dixon, A. M. (2016) Soluble expression, purification and functional characterisation of carboxypeptidase G2 and its individual domains, Protein Expr. Purif., 127, 44-52, doi: 10.1016/J.PEP.2016.06.015.
29. Agostini, F., Cirillo, D., Livi, C. M., DelliPonti, R., and Tartaglia, G. G. (2014) ccSOL omics: a webserver for solubility prediction of endogenous and heterologous expression in Escherichia coli, Bioinformatics, 30, 2975-2977, doi: 10.1093/bioinformatics/btu420.
30. Hebditch, M., Carballo-Amador, M. A., Charonis, S., Curtis, R., and Warwicker, J. (2017) Protein-Sol: a web tool for predicting protein solubility from sequence, Bioinformatics, 33, 3098-3100, doi: 10.1093/bioinformatics/btx345.