БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 12, с. 1918–1927

УДК 577.152.1

Идентификация Na+-перекачивающей цитохромоксидазы в мембранах экстремально алкалифильной бактерии Thioalkalivibrio

© 2020 М.С. Мунтян 1*, Д.А. Морозов 1, Ю.Ф. Леонова 2, Т.В. Овчинникова 2

НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Россия; электронная почта: muntyan@genebee.msu.ru

ФГБУН Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, Россия

Поступила в редакцию 26.07.2020
После доработки 01.09.2020
Принята к публикации 01.09.2020

DOI: 10.31857/S0320972520120143

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Na+-насос, цитохром-с-оксидаза, экстремофилия, алкалифилия, оксидаза cbb3-типа.

Аннотация

Впервые доказательство функционирования кислород-редуктазного Na+-насоса (Na+-перекачивающей цитохром-c-оксидазы cbb3-типа) было получено при изучении дыхательной цепи экстремально алкалифильной бактерии Thioalkalivibrio versutus [Muntyan, M. S., et al. (2015) Cytochrome cbb3 of Thioalkalivibrio is a Na+-pumping cytochrome oxidase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 112, 7695-7700]. В настоящей работе проведена иммунодетекция и идентификация этой Na+-перекачивающей цитохром-c-оксидазы, являющейся продуктом оперона ccoNOQP. С помощью кроличьих поликлональных антител, полученных на предсказанную С-концевую аминокислотную последовательность каталитической субъединицы, показано, что оксидаза cbb3-типа синтезируется в клетках бактерии и локализуется в её мембранах; субъединица оксидазы с мол. массой 48 кДа является каталитической, СcoN; субъединицы с мол. массами 29 и 34 кДа, СcoO и СcoP, соответственно являются цитохромами c. Определены теоретические значения pI субъединиц СcoN, СcoO и СcoP. Показано, что части субъединиц CcoO и CcoP, экспонированные в водную фазу на P-стороне цитоплазматической мембраны клеток, обогащены отрицательно заряженными аминокислотными остатками, в отличие от граничащих с водной фазой частей интегральной субъединицы CcoN. Таким образом, Na+-перекачивающая цитохром-c-оксидаза T. versutus как по функции, так и по структуре демонстрирует приспособленность к экстремально щелочным условиям.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Исследования выполнены при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований в течение нескольких проектных периодов: геномные исследования (проекты 02-04-49107-а, 05-04-49504-а), исследование белков (проект 20-04-01105-а).

Благодарности

Авторы выражают благодарность В.П. Скулачеву за постоянное внимание к работе и плодотворное обсуждение результатов, Н.В. Поздняковой за помощь в работе с животными.

Конфликт интересов

Авторы не имеют конфликта интересов в финансовой или каких-либо иных сферах деятельности.

Соблюдение этических норм

Уход за кроликами и их использование в экспериментах осуществляли в соответствии с протоколами, разработанными и утвержденными Комитетом по этике работы с животными в Институте физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского. Все процедуры выполняли в соответствии с принципами Федерации сообществ по научным исследованиям с лабораторными животными (FELASA).

Список литературы

1. Tokuda, H., and Unemoto, T. (1984) Na+ is translocated at NADH: quinone oxidoreductase segment in the respiratory chain of Vibrio alginolyticus, J. Biol. Chem., 259, 7785-7790.

2. Skulachev, V. P. (1992) The laws of cell energetics, Eur. J. Biochem., 208, 203-209, doi: 10.1111/j.1432-1033.1992.tb17175.x.

3. Skulachev, V. P. (1984) Sodium bioenergetics, Trends Biochem. Sci., 9, 483-485, doi: 10.1016/0968-0004(84)90317-7.

4. Muntyan, M. S., Cherepanov, D. A., Malinen, A. M., Bloch, D. A., Sorokin, D. Y., et al. (2015) Cytochrome cbb3 of Thioalkalivibrio is a Na+-pumping cytochrome oxidase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 112, 7695-7700, doi: 10.1073/pnas.1417071112.

5. Gribaldo, S., Talla, E., and Brochier-Armanet, C. (2009) Evolution of the haem copper oxidases superfamily: a rooting tale, Trends Biochem. Sci., 34, 375-381, doi: 10.1016/j.tibs.2009.04.002.

6. Saraste, M., and Castresana, J. (1994) Cytochrome oxidase evolved by tinkering with denitrification enzymes, FEBS Lett., 341, 1-4, doi: 10.1016/0014-5793(94)80228-9.

7. Buschmann, S., Warkentin, E., Xie, H., Langer, J. D., Ermler, U., and Michel, H. (2010) The structure of cbb3 cytochrome oxidase provides insights into proton pumping, Science, 329, 327-330, doi: 10.1126/science.1187303.

8. Sorokin, D. Y., Banciu, H., Robertson, L. A., Kuenen, J. G., Muntyan, M. S., and Muyzer, G. (2013) Halophilic and haloalkaliphilic sulfur-oxidizing bacteria, in The Prokaryotes: Prokaryotic Physiology and Biochemistry, (Rosenberg, E., DeLong, E., Lory, S., Stackebrandt, E., and Thompson, F., eds) Springer, Berlin, Heidelberg, pp. 529-554, doi: 10.1007/978-3-642-30141-4_77.

9. Malinen, A. M., Belogurov, G. A., Baykov, A. A., and Lahti, R. (2007) Na+-pyrophosphatase: a novel primary sodium pump, Biochemistry, 46, 8872-8878, doi: 10.1021/bi700564b.

10. Li, H., Sineshchekov, O. A., da Silva, G. F., and Spudich, J. L. (2015) In vitro demonstration of dual light-driven Na+/H+ pumping by a microbial rhodopsin, Biophys. J., 109, 1446-1453, doi: 10.1016/j.bpj.2015.08.018.

11. Грищук Ю. В., Мунтян М. С., Попова И. В., Сорокин Д. Ю. (2003) Транспорт ионов, сопряженный с работой терминальной оксидазы экстремально щелочелюбивой солеустойчивой бактерии рода Thioalkalivibrio, Биохимия, 68, 477-483.

12. Sorokin, D. Y., Muntyan, M. S., Toshchakov, S. V., Korzhenkov, A., and Kublanov, I. V. (2018) Phenotypic and genomic properties of a novel deep-lineage haloalkaliphilic member of the phylum Balneolaeota from soda lakes possessing Na+-translocating proteorhodopsin, Front. Microbiol., 9, 2672, doi: 10.3389/fmicb.2018.02672.

13. Sorokin, D. Y., Lysenko, A. M., Mityushina, L. L., Tourova, T. P., Jones, B. E., et al. (2001) Thioalkalimicrobium aerophilum gen. nov., sp. nov. and Thioalkalimicrobium sibericum sp. nov., and Thioalkalivibrio versutus gen. nov., sp. nov., Thioalkalivibrio nitratis sp. nov., novel and Thioalkalivibrio denitrificancs sp. nov., novel obligately alkaliphilic and obligately chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing bacteria from soda lakes, Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 51, 565-580, doi: 10.1099/00207713-51-2-565.

14. Thompson, J. D., Higgins, D. G., and Gibson, T. J. (1994) CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positionspecific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Res., 22, 4673-4680, doi: 10.1093/nar/22.22.4673.

15. Muntyan, M. S., and Skripnikova, E. V. (1993) Two types of terminal oxidase in alkalotolerant Bacillus FTU, Biochim. Biophys. Acta, 1143, 142-146, doi: 10.1016/0005-2728(93)90136-4.

16. Schägger, H., and von Jagow, G. (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa, Anal. Biochem., 166, 368-379, doi: 10.1016/0003-2697(87)90587-2.

17. Davis, B. J. (1964) Disk electrophoresis – II. Method and application to human serum proteins, Ann. N. Y. Acad. Sci., 121, 404-427.

18. Thomas, P. E., Ryan, D., and Levin, W. (1976) An improved staining procedure for the detection of the peroxidase activity of cytochrome P-450 on sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels, Anal. Biochem., 75, 168-176, doi: 10.1016/0003-2697(76)90067-1.

19. Muntyan, M. S., Bloch, D. A., Ustiyan, V. S., and Drachev, L. A. (1993) Kinetics of CO binding to H+-motive oxidases of the caa3-type from Bacillus FTU and of the o-type from Escherichia coli, FEBS Lett., 327, 351-354, doi: 10.1016/0014-5793(93)81019-V.

20. Towbin, H., Staehelin, T., and Gordon, J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350-4354, doi: 10.1073/pnas.76.9.4350.

21. Гринкевич В. А., Лысенко А. М., Мунтян М. С., Скрипникова Е. В., Африкян Э. К. (1997) Идентификация штамма Bacillus sp. FTU и изучение гомологии оксидаз сaa3-типа, Биохимия, 62, 842-849.

22. Waterhouse, A., Bertoni, M., Bienert, S., Studer, G., Tauriello, G., et al. (2018) SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes, Nucleic Acids Res., 46, W296-W303, doi: 10.1093/nar/gky427.

23. Gasteiger, E., Hoogland, C., Gattiker, A., Duvaud, S., Wilkins, M. R., Appel, R. D., Bairoch, A. (2005) Protein identification and analysis tools on the ExPASy server, in The Proteomics Protocols Handbook (Walker, J. M., ed.) Humana Press, Totowa, New Jersey, pp. 571-607, doi: 10.1385/1-59259-890-0:571.

24. Toledo-Cuevas, M., Barquera, B., Gennis, R. B., Wikström, M., and García-Horsman, J. A. (1998) The cbb3-type cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides, a proton-pumping heme-copper oxidase, Biochim. Biophys. Acta, 1365, 421-434, doi: 10.1016/S0005-2728(98)00095-4.

25. Myllykallio, H., and Liebl, U. (2000) Dual role for cytochrome oxidase in clinically relevant proteobacteria, Trends Microbiol., 8, 542-543, doi: 10.1016/S0966-842X(00)91831-6.

26. Garcia-Horsman, J. A., Berry, E., Shapleigh, J. P., Alben, J. O., and Gennis, R. B. (1994) A novel cytochrome c oxidase from Rhodobacter sphaeroides that lacks CuA, Biochemistry, 33, 3113-3119, doi: 10.1021/bi00176a046.

27. Gray, K. A., Grooms, M., Myllykallio, H., Moomaw, C., Slaughter, C., and Daldal, F. (1994) Rhodobacter capsulatus contains a novel cb-type cytochrome c oxidase without a CuA center, Biochemistry, 33, 3120-3127, doi: 10.1021/bi00176a047.

28. Rauhamäki, V., Bloch, D. A., and Wikström, M. (2012) Mechanistic stoichiometry of proton translocation by cytochrome cbb3, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109, 7286-7291, doi: 10.1073/pnas.1202151109.

29. Thöny-Meyer, L., Beck, C., Preisig, O., and Hennecke, H. (1994) The ccoNOQP gene cluster codes for a cb-type cytochrome oxidase that functions in aerobic respiration of Rhodobacter capsulatus, Mol. Microbiol., 14, 705-716, doi: 10.1111/j.1365-2958.1994.tb01308.x.

30. Zeilstra-Ryalls, J. H., Gabbert, K., Mouncey, N. J., Kaplan, S., and Kranz, R. G. (1997) Analysis of the fnrL gene and its function in Rhodobacter capsulatus, J. Bacteriol., 179, 7264-7273, doi: 10.1128/jb.179.23.7264-7273.1997.

31. Preisig, O., Zufferey, R., Thöny-Meyer, L., Appleby, C. A., and Hennecke, H. (1996) A high-affinity cbb3-type cytochrome oxidase terminates the symbiosis-specificrespiratory chain of Bradyrhizobium japonicum, J. Bacteriol., 178, 1532-1538, doi: 10.1128/jb.178.6.1532-1538.1996.

32. Zufferey, R., Arslan, E., Thöny-Meyer, L., and Hennecke, H. (1998) How replacements of the 12 conserved histidines of subunit I affect assembly, cofactor binding, and enzymatic activity of the Bradyrhizobium japonicum cbb3-type oxidase, J. Biol. Chem., 273, 6452-6459, doi: 10.1074/jbc.273.11.6452.

33. Sorokin, D. Y., Cherepanov, A., de Vries, S., and Kuenen, G. J. (1999) Identification of cytochrome c oxidase in the alkaliphilic, obligately chemolithoautotrophic, sulfur-oxidizing bacterium ‘Thioalcalomicrobium aerophilum’strain AL 3, FEMS Microbiol. Lett., 179, 91-99, doi: 10.1016/S0378-1097(99)00398-5.

34. Tsukita, S., Koyanagi, S., Nagata, K., Koizuka, H., Akashi, H., Shimoyama, T., Tamura, T., and Sone, N. (1999) Characterization of a cb-type cytochrome c oxidase from Helicobacter pylori, J. Biochem., 125, 194-201, doi: 10.1093/oxfordjournals.jbchem.a022259.

35. Urbani, A., Gemeinhardt, S., Warne, A., and Saraste, M. (2001) Properties of the detergent solubilised cytochrome c oxidase (cytochrome cbb3) purified from Pseudomonas stutzeri, FEBS Lett., 508, 29-35, doi: 10.1016/S0014-5793(01)03006-X.

36. Granados-Baeza, M. J., Gómez-Hernández, N., Mora, Y., Delgado, M. J., Romero, D., and Girard, L. (2007) Novel reiterated Fnr-type proteins control the production of the symbiotic terminal oxidase cbb3 in Rhizobium etli CFN42, Mol. Plant-Microbe Interact., 20, 1241-1249, doi: 10.1094/MPMI-20-10-1241.

37. De Gier, J. W. L., Lübben, M., Reijnders, W. N., Tipker, C. A., Slotboom, D. J., van Spanning, R. J., Stouthamer, A. H., and van der Oost, J. (1994) The terminal oxidases of Paracoccus denitrificans, Mol. Microbiol., 13, 183-196, doi: 10.1111/j.1365-2958.1994.tb00414.x.

38. Raitio, M., and Wikström, M. (1994) An alternative cytochrome oxidase of Paracoccus denitrificans functions as a proton pump, Biochim. Biophys. Acta, 1186, 100-106, doi: 10.1016/0005-2728(94)90140-6.

39. Arslan, E., Kannt, A., Thöny-Meyer, L., and Hennecke, H. (2000) The symbiotically essential cbb3-type oxidase of Bradyrhizobium japonicum is a proton pump, FEBS Lett., 470, 7-10, doi: 10.1016/S0014-5793(00)01277-1.

40. Kaim, G., and Dimroth, P. (1995) A double mutation in subunit c of the Na+-specific F1F0-ATPase of Propionigenium modestum results in a switch from Na+ to H+-coupled ATP synthesis in the Escherichia coli host cells, J. Mol. Biol., 253, 726-738, doi: 10.1006/jmbi.1995.0586.

41. Kaim, G., Wehrle, F., Gerike, U., and Dimroth, P. (1997) Molecular basis for the coupling ion selectivity of F1F0 ATP synthases: probing the liganding groups for Na+ and Li+ in the c subunit of the ATP synthase from Propionigenium modestum, Biochemistry, 36, 9185-9194, doi: 10.1021/bi970831q.

42. Dimroth, P. (2000) Operation of the F0 motor of the ATP synthase, Biochim. Biophys. Acta, 1458, 374-386, doi: 10.1016/s0005-2728(00)00088-8.

43. Inoue, K., Ono, H., Abe-Yoshizumi, R., Yoshizawa, S., Ito, H., Kogure, K., and Kandori, H. (2013) A light-driven sodium ion pump in marine bacteria, Nat. Commun., 4, 1-10, doi: 10.1038/ncomms2689.

44. Mamedov, M. D., Mamedov, A. M., Bertsova, Y. V., and Bogachev, A. V. (2016) A single mutation converts bacterial Na+-transporting rhodopsin into an H+ transporter, FEBS Lett., 590, 2827-2835. doi: 10.1002/1873-3468.12324.

45. Luoto, H. H., Baykov, A. A., Lahti, R., Malinen, A. M. (2013) Membrane-integral pyrophosphatase subfamily capable of translocating both Na+ and H+, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 110, 1255-1260, doi: 10.1073/pnas.1217816110.

46. Luoto, H. H., Nordbo, E., Baykov, A. A., Lahti, R., and Malinen, A. M. (2013) Membrane Na+-pyrophosphatases can transport protons at low sodium concentrations, J. Biol. Chem., 288, 35489-35499, doi: 10.1074/jbc.M113.510909.

47. Efiok, B. J., Webster, D. A. (1990) A cytochrome that can pump sodium ion, Biochem. Biophys. Res. Commun., 173, 370-375, doi: 10.1016/s0006-291x(05)81067-8.

48. Chung, Y. T., Stark, B. C., and Webster, D. A. (2006) Role of Asp544 in subunit I for Na+ pumping by Vitreoscilla cytochrome bo, Biochem. Biophys. Res. Commun., 348, 1209-1214, doi: 10.1016/j.bbrc.2006.07.184.

49. Efiok, B. J., and Webster, D. A. (1990) Respiratory-driven Na+ electrical potential in the bacterium Vitreoscilla, Biochemistry, 29, 4734-4739, doi: 10.1021/bi00471a030.

50. Graf, S., Brzezinski, P., and von Ballmoos, C. (2019) The proton pumping bo oxidase from Vitreoscilla, Sci. Rep., 9, 4766, doi: 10.1038/s41598-019-40723-2.

51. Banciu, H. L., and Muntyan, M. S. (2015) Adaptive strategies in the double-extremophilic prokaryotes inhabiting soda lakes, Curr. Opin. Microbiol., 25, 73-79, doi: 10.1016/j.mib.2015.05.003.

52. Мунтян М. С., Морозов Д. А., Клишин С. С., Хитрин Н. В., Коломийцева Г. Я. (2012) Измерение электрического потенциала на мембранах экстремально щелочелюбивых бактерий рода Thioalkalivibrio, Биохимия, 77, 1113-1121.

53. Krulwich, T. A., Liu, J., Morino, M., Fujisawa, M., Ito, M., and Hicks, D. B. (2011) Adaptive mechanisms of extreme alkaliphiles, in Extremophiles handbook (Horikoshi, K., Antranikian, G., Bull, A. T., Robb, F. T., and Stetter, K. O., eds) Springer, Tokyo, pp. 119-139, doi: 10.1007/978-4-431-53898-1_2.6.

54. Krulwich, T. A., and Ito, M. (2013) Alkaliphilic prokaryotes, in The prokaryotes – Prokaryotic Communities and Ecophysiology (Rosenberg, E., DeLong, E. F., Lory, S., Stackebrandt, E., and Thompson, F., eds) Springer, Berlin, Heidelberg, pp. 441-469, doi: 10.1007/978-3-642-30123-0_58.

55. Lewis, R. J., Belkina, S., and Krulwich, T. A. (1980) Alkalophiles have much higher cytochrome contents than conventional bacteria and than their own non-alkalophilic mutant derivatives, Biochem. Biophys. Res. Commun., 95, 857-863, doi: 10.1016/0006-291x(80)90866-9.

56. Мунтян М. С., Попова И. В., Блох Д. А., Скрипникова Е. В., Устиян B. C. (2005). Энергетика щелочелюбивых представителей рода Bacillus, Биохимия, 70, 171-176.

57. Krulwich, T. A., Ito, M., and Guffanti, A. A. (2001) The Na+-dependence of alkaliphily in Bacillus, Biochim. Biophys. Acta, 1505, 158-168, doi: 10.1016/s0005-2728(00)00285-1.

58. Мунтян М. С., Блох Д. А. (2008) Измерение среднеточечного окислительно-восстановительного потенциала ковалентно-связанного цитохрома c в терминальной оксидазе алкалофильной бактерии Bacillus pseudofirmus FTU, Биохимия, 73, 131-136.