БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 12, с. 1858–1872

УДК 577.24

Новый митохондриально-направленный протонофор и антимикробный агент на основе 7-нитробензо-2-окса-1,3-диазола (NBD), ковалентно связанного с трифенилфосфониевым катионом

© 2020 И.Р. Яубасарова 1,2, Л.С. Хайлова 1, П.А. Назаров 1, Т.И. Рокицкая 1, Д.Н. Силачев 1, Т.И. Данилина 1, Е.Ю. Плотников 1, С.С. Денисов 1,3, Р.С. Кирсанов 1, Г.А. Коршунова 1, Е.А. Котова 1, Д.Б. Зоров 1, Ю.Н. Антоненко 1*

НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Россия; электронная почта: antonen@genebee.msu.ru

Химический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Россия

Department of Biochemistry, University of Maastricht, Cardiovascular Research Institute Maastricht, Universiteitssingel 50, 6229 ER, Maastricht, The Netherlands

Поступила в редакцию 07.06.2020
После доработки 22.07.2020
Принята к публикации 25.07.2020

DOI: 10.31857/S0320972520120106

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: разобщитель, протонофор, окислительное фосфорилирование, митохондрии, дыхание, мембранный потенциал.

Аннотация

Присоединение липофильных катионов к различным малым молекулам широко используется для получения митохондриально-направленных соединений, обладающих специфической активностью. В настоящей работе получена серия производных популярного флуоресцентного красителя 7-нитробенз-2-окса-1,3-диазола (NBD). Согласно ранее полученным данным (Denisov et al. (2014) Bioelectrochemistry, 98, 30-38), алкильные производные NBD способны разобщать изолированные митохондрии при концентрациях в десятки микромолей, несмотря на очень высокое значение pKa (~11) диссоциирующей группы. Cинтезировано ряд производных трифенилфосфония (TPP), связанных с NBD через углеводородные спейсеры различной длины: C5, C8, C10 и C12 (аналоги mitoNBD). Эти соединения энергозависимо накапливались в митохондриях. NBD-C10-TPP (C10-mitoNBD) проявлял протонофорную активность на искусственных липидных мембранах (липосомах) и разобщал изолированные митохондрии при микромолярных концентрациях, тогда как производное с коротким линкером, NBD-C5-TPP (C5-mitoNBD), практически не проявляло протонофорного и разобщающего действия. В согласии с этими данными, C10-mitoNBD был намного более эффективным, чем C5-mitoNBD, в подавлении роста бактерии Bacillus subtilis. Из изученных аналогов C10-mitoNBD и C12-mitoNBD проявляли наибольшую антибактериальную активность. Кроме того, C10-mitoNBD оказывал нейропротекторное действие на модели травмы головного мозга крысы.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Синтез Cn-mitoNBD, измерение pKa, изучение индукции протонной проницаемости на липосомах и плоских БЛМ, исследование влияния Cn-mitoNBD на мембранный потенциал и скорость дыхания митохондрий, изучение антимикробной активности производных NBD были осуществлены при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант 16-14-10025). Измерение накопления Cn-mitoNBD в митохондриях было проведено при финансовой поддержке РНФ (грант 19-74-00015). Конфокальная микроскопия эукариотических клеток с C10-mitoNBD и изучение нейропротекторного действия C10-mitoNBD на модели фокальной ишемии головного мозга крысы были выполнены при поддержке Российского научного фонда (грант 19-14-00173).

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Экспериментальные исследования с использованием лабораторных животных выполнены в соответствии с «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации», утвержденными приказом Министерства здравоохранения и социального развития № 708н от 23.08.2010, а также в соответствии с Международным соглашением о гуманном обращении с животными European Community Council directives 2010/63/EU, и были одобрены комитетом по этике НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ.

Дополнительные материалы

Приложение к статье на английском языке опубликовано на сайте журнала «Biochemistry» (Moscow) (http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya/) и на сайте издательства Springer (https://link.springer.com/journal/10541), том 85, вып. 12, 2020.

Список литературы

1. Childress, E. S., Alexopoulos, S. J., Hoehn, K. L., and Santos, W. L. (2018) Small molecule mitochondrial uncouplers and their therapeutic potential, J. Med. Chem., 61, 4641-4655, doi: 10.1021/acs.jmedchem.7b01182.

2. Gao, J.-L., Zhao, J., Zhu, H.-B., Peng, X., Zhu, J.-X., et al. (2018) Characterizations of mitochondrial uncoupling induced by chemical mitochondrial uncouplers in cardiomyocytes, Free Radic. Biol. Med., 124, 288-298, doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2018.06.020.

3. Desquiret, V., Loiseau, D., Jacques, C., Douay, O., Malthièry, Y., Ritz, P., and Roussel, D. (2006) Dinitro-phenol-induced mitochondrial uncoupling in vivo triggers respiratory adaptation in HepG2 cells, Biochim. Biophys. Acta, 1757, 21-30, doi: 10.1016/j.bbabio.2005.11.005.

4. Khailova, L. S., Silachev, D. N., Rokitskaya, T. I., Avetisyan, A. V., Lyamsaev, K. G., et al. (2014) A short-chain alkyl derivative of Rhodamine 19 acts as a mild uncoupler of mitochondria and a neuroprotector, Biochim. Biophys. Acta Bioenergetics, 1837, 1739-1747, doi: 10.1016/j.bbabio.2014.07.006.

5. Denisov, S. S., Kotova, E. A., Plotnikov, E. Y., Tikhonov, A. A., Zorov, D. B., Korshunova, G. A., and Antonenko, Y. N. (2014) A mitochondria-targeted protonophoric uncoupler derived from fluorescein, Chem. Commun., 50, 15366-15369, doi: 10.1039/c4cc04996a.

6. Biasutto, L., Sassi, N., Mattarei, A., Marotta, E., Cattelan, P., et al. (2010) Impact of mitochondriotropic quercetin derivatives on mitochondria, Biochim. Biophys. Acta, 1797, 189-196, doi: 10.1016/j.bbabio.2009.10.001.

7. Wang, J., He, H., Xiang, C., Fan, X. Y., Yang, L. Y., Yuan, L., Jiang, F. L., and Liu, Y. (2018) Uncoupling effect of F16 is responsible for its mitochondrial toxicity and anticancer activity, Toxicol. Sci., 161, 431-442, doi: 10.1093/toxsci/kfx218.

8. Rokitskaya, T. I., Terekhova, N. V., Khailova, L. S., Kotova, E. A., Plotnikov, E. Y., Zorov, D. B., Tatarinov, D. A., and Antonenko, Y. N. (2019) Zwitterionic protonophore derived from 2-(2-hydroxyaryl)alkenylphosphonium as an uncoupler of oxidative phosphorylation, Bioconjug. Chem., 30, 2435-2443, doi: 10.1021/acs.bioconjchem.9b00516.

9. Schwaller, M. A., Allard, B., Lescot, E., and Moreau, F. (1995) Protonophoric activity of ellipticine and isomers across the energy-transducing membrane of mitochondria, J. Biol. Chem., 270, 22709-22713, doi: 10.1074/jbc.270.39.22709.

10. Nagamune, H., Fukushima, Y., Takada, J., Yoshida, K., Unami, A., Shimooka, T., and Terada, H. (1993) The lipophilic weak base (Z)-5-methyl-2-[2-(1-naphthyl) ethenyl]-4-piperidinopyridine (AU-1421) is a potent protonophore type cationic uncoupler of oxidative phosphorylation in mitochondria, Biochim. Biophys. Acta, 1141, 231-237, doi: 10.1016/0005-2728(93)90047-j.

11. Ross, M. F., Kelso, G. F., Blaikie, F. H., James, A. M., Cochemé, H. M., et al. (2005) Lipophilic triphenylphosphonium cations as tools in mitochondrial bioenergetics and free radical biology, Biochemistry (Moscow), 70, 222-230, doi: 10.1007/s10541-005-0104-5.

12. Severin, F. F., Severina, I. I., Antonenko, Y. N., Rokitskaya, T. I., Cherepanov, D. A., et al. (2010) Penetrating cation/fatty acid anion pair as a mitochondria-targeted protonophore, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107, 663-668, doi: 10.1073/pnas.0910216107.

13. Antonenko, Y. N., Denisov, S. S., Silachev, D. N., Khailova, L. S., Jankauskas, S. S., et al. (2016) A long-linker conjugate of fluorescein and triphenylphosphonium as mitochondria-targeted uncoupler and fluorescent neuro- and nephroprotector, Biochim. Biophys. Acta, 1860, 2463-2473, doi: 10.1016/j.bbagen.2016.07.014.

14. Martynov, V. I., Pakhomov, A. A., Popova, N. V., Deev, I. E., and Petrenko, A. G. (2016) Synthetic fluorophores for visualizing biomolecules in living systems, Acta Naturae, 8, 37-51, doi: 10.32607/20758251-2016-8-4-33-46.

15. Popova, L. B., Kamysheva, A. L., Rokitskaya, T. I., Korshunova, G. A., Kirsanov, R. S., Kotova, E. A., and Antonenko, Yu. N. (2019) Protonophoric and photodynamic effects of fluorescein decyl(triphenyl)phosphonium ester on the electrical activity of pond snail neurons, Biochemistry (Moscow), 84, 1151-1165, doi: 10.1134/S0006297919100043.

16. Denisov, S. S., Kotova, E. A., Khailova, L. S., Korshunova, G. A., and Antonenko, Y. N. (2014) Tuning the hydrophobicity overcomes unfavorable deprotonation making octylamino-substituted 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (n-octylamino-NBD) a protonophore and uncoupler of oxidative phosphorylation in mitochondria, Bioelectrochemistry, 98, 30-38, doi: 10.1016/j.bioelechem.2014.02.002.

17. Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., and Wescott, W. C. (1963) Methods for the formation of single bimolecular lipid membranes in aqueous solution, J. Phys. Chem., 67, 534-535, doi: 10.1021/j100796a529.

18. Johnson, D., and Lardy, H. (1967) Isolation of liver or kidney mitochondria, Methods Enzymol., 10, 94-96, doi: 10.1016/0076-6879(67)10018-9.

19. Akerman, K. E., and Wikstrom, M. K. (1976) Safranine as a probe of the mitochondrial membrane potential, FEBS Lett., 68, 191-197, doi: 10.1016/0014-5793(76)80434-6.

20. Perevoshchikova, I. V., Zorov, D. B., and Antonenko, Y. N. (2008) Peak intensity analysis as a method for estimation of fluorescent probe binding to artificial and natural nanoparticles: tetramethylrhodamine uptake by isolated mitochondria, Biochim. Biophys. Acta, 1778, 2182-2190, doi: 10.1016/j.bbamem.2008.04.008.

21. Perevoshchikova, I. V., Kotova, E. A., and Antonenko, Yu. N. (2011) Fluorescence correlation spectroscopy in biology, chemistry, and medicine, Biochemistry (Moscow), 76, 497-516, doi: 10.1134/S0006297911050014.

22. Krichevsky, O., and Bonnet, G. (2002) Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications, Rep. Prog. Phys., 65, 251-297, doi: 10.1088/0034-4885/65/2/203.

23. Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., and Webb, W. W. (2002) Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review, Biochemistry, 41, 697-705, doi: 10.1021/bi0118512.

24. Antonenko, Y. N., Perevoshchikova, I. V., Rokitskaya, T. I., Simonyan, R. A., Tashlitsky, V. V., and Skulachev, V. P. (2012) Effect of liposomes on energy-dependent uptake of the antioxidant SkQR1 by isolated mitochondria, J. Bioenerg. Biomembr., 44, 453-460, doi: 10.1007/s10863-012-9449-9.

25. Firsov, A. M., Kotova, E. A., Korepanova, E. A., Osipov, A. N., and Antonenko, Y. N. (2015) Peroxidative permeabilization of liposomes induced by cytochrome c/cardiolipin complex, Biochim. Biophys. Acta, 1848, 767-774, doi: 10.1016/j.bbamem.2014.11.027.

26. CLSI, methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, Approved Standard, 9th ed., CLSI document M07-A9; https://clsi.org/media/ 1928/m07ed11_sample.pdf.

27. Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., and Dail, W. G. (1981) Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat, Brain Res., 211, 67-77, doi: 10.1016/0006-8993(81)90067-6.

28. Silachev, D. N., Plotnikov, E. Y., Babenko, V. A., Danilina, T. I., Zorova, L. D., Pevzner, I. B., Zorov, D. B., and Sukhikh, G. T. (2015) Intra-arterial administration ofmultipotent mesenchymal stromal cells promotes functional recovery of the brain after traumatic brain injury, Bull. Exp. Biol. Med., 159, 528-533, doi: 10.1007/s10517-015-3009-3.

29. De Ryck, M., Van Reempts, J., Borgers, M., Wauquier, A., and Janssen, P. A. (1989) Photochemical stroke model: flunarizine prevents sensorimotor deficits after neocortical infarcts in rats, Stroke, 20, 1383-1390, doi: 10.1161/01.str.20.10.1383.

30. Perevoshchikova, I. V., Sorochkina, A. I., Zorov, D. B., and Antonenko, Y. N. (2009) Safranin O as a fluorescent probe for mitochondrial membrane potential studied on a single particle level and in suspension, Biochemistry (Moscow), 74, 663-671, doi: 10.1134/s000629790906011x.

31. Starkov, A. A., Dedukhova, V. I., and Skulachev, V. P. (1994) 6-Ketocholestanol abolishes the effect of the most potent uncouplers of oxidative phosphorylation in mitochondria, FEBS Lett., 355, 305-308, doi: 10.1016/0014-5793(94)01211-3.

32. Plotnikov, E. Yu., Silachev, D. N., Yankauskas, S. S., Rokitskaya, T. I., Chupyrkina, A. A., et al. (2012) Mild uncoupling of respiration and oxidative phosphorylation as a mechanism providing nephron- and neuroprotective effects of penetrating cations of the SkQ family, Biochemistry (Moscow), 77, 1029-1037, doi: 10.1134/S0006297912090106.

33. Silachev, D. N., Khailova, L. S., Babenko, V. A., Gulyaev, M. V., Kovalchuk, S. I., et al. (2014) Neuroprotective effect of glutamate-substituted analog of gramicidin A is mediated by the uncoupling of mitochondria, Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj., 1840, 3434-3442, doi: 10.1016/j.bbagen.2014.09.002.

34. Lim, H. B., and Smith, M. (2007) Systemic complications after head injury: a clinical review, Anaesthesia, 62, 474-482, doi: 10.1111/j.1365-2044.2007.04998.x.

35. Khailova, L. S., Nazarov, P. A., Sumbatyan, N. V., Korshunova, G. A., Rokitskaya, T. I., et al. (2015) Un-coupling and toxic action of alkyltriphenylphosphonium cations on mitochondria and the bacterium Bacillus subtilis as a function of alkyl chain length, Biochemistry (Moscow), 80, 1589-1597, doi: 10.1134/S000629791512007X.

36. Nazarov, P. A., Osterman, I. A., Tokarchuk, A. V., Karakozova, M. V., Korshunova, G. A., et al. (2017) Mitochondria-targeted antioxidants as highly effective antibiotics, Sci. Rep., 7, 1394, doi: 10.1038/s41598-017-00802-8.

37. Belosludtsev, K. N., Tenkov, K. S., Vedernikov, A. A., Belosludtseva, N. V., and Dubinin, M. V. (2019) Dodecyltriphenylphosphonium as an inducer of potassium-dependent permeability of rat liver mitochondria, Biochemistry (Moscow) Suppl. A Membr. Cell Biol., 13, 310-318, doi: 10.1134/S1990747819040044.

38. Mattiasson, G., Shamloo, M., Gido, G., Mathi, K., Tomasevic, G., et al. (2003) Uncoupling protein-2 prevents neuronal death and diminishes brain dysfunction after stroke and brain trauma, Nat. Med., 9, 1062-1068, doi: 10.1038/nm903.

39. Andrews, Z. B., Diano, S., and Horvath, T. L. (2005) Mitochondrial uncoupling proteins in the CNS: in support of function and survival, Nat. Rev. Neurosci., 6, 829-840, doi: 10.1038/nrn1767.

40. Normoyle, K. P., Kim, M., Farahvar, A., Llano, D., Jackson, K., and Wang, H. (2015) The emerging neuroprotective role of mitochondrial uncoupling protein-2 in traumatic brain injury, Transl. Neurosci., 6, 179-186, doi: 10.1515/tnsci-2015-0019.

41. Pandya, J. D., Pauly, J. R., Nukala, V. N., Sebastian, A. H., Day, K. M., et al. (2007) Post-injury administration of mitochondrial uncouplers increases tissue sparing and improves behavioral outcome following traumatic brain injury in rodents, J. Neurotrauma, 24, 798-811, doi: 10.1089/neu.2006.3673.

42. Geisler, J. G., Marosi, K., Halpern, J., and Mattson, M. P. (2017) DNP, Mitochondrial uncoupling and neuroprotection: a little dab’ll do ya, Alzheimers Dement., 13, 582-591, doi: 10.1016/j.jalz.2016.08.001.

43. Geisler, J. G. (2019) 2,4 Dinitrophenol as medicine, Cells, 8, 280, doi: 10.3390/cells8030280.

44. Nazarov, P. A., Kirsanov, R. S., Denisov, S. S., Khailova, L. S., Karakozova, M. V., et al. (2020) Fluorescein derivatives as antibacterial agents acting via membrane depolarization, Biomolecules, 10, 309, doi: 10.3390/biom10020309.