БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 11, с. 1540–1549

УДК 577.18

Ингибирование хламидийной инфекции путем CRISPR/Cas9-SAM опосредованного усиления экспрессии генов пептидогликан-распознающих белков человека в клетках линии HeLa

© 2020 П.А. Бобровский 1*, В.Д. Мороз 1, В.Н. Лавренова 1,2, В.А. Манувера 1, В.Н. Лазарев 1

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины ФМБА России, 119435 Москва, Россия; электронная почта: pbobrovskiy@gmail.com

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991 Москва, Россия

Поступила в редакцию 07.07.2020
После доработки 22.08.2020
Принята к публикации 23.08.2020

DOI: 10.31857/S0320972520110032

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: пептидогликан, Chlamydia trachomatis, PGLYRP, CRISPR/Cas9.

Аннотация

Глобальная проблема роста антибиотико­резистентности микроорганизмов делает актуальным поиск новых природных веществ, обладающих антибакте­риальными свойствами. К данной группе относят пептидогликан-распознающие белки (PGLYRP), являющиеся компонентами врожденного иммунитета многих организмов, в том числе и человека. Эти белки обладают уникальным механизмом действия, позволяющим избегать формирования резистентности к ним бактерий, а также быть активными как против грамполо­жительных, так и против грамотри­цательных бактерий. Однако применение рекомбинантных пептидогликан-распознающих белков не всегда целесообразно из-за сложности локальной доставки белков и их стабильности, в связи с этим представляется актуальным активация компонентов собственного врожденного иммунитета. Целью данного исследования было увеличить уровень экспрессии собственных генов пептидогликан-распознающих белков человека в клетках линии HeLa с помощью технологии редактирования генома, используя синергичные медиаторы активации (CRISPR/Cas9-SAM), чтобы оценить антихлами­дийный эффект PGLYRP. Мы показали активацию генов двухкомпо­нентной системы хламидий ctcB-ctcC, играющей ключевую роль в механизме действия пептидогликан-распознающих белков. Нами были получены клетки линии HeLa, трансдуци­рованные лентивирусами, кодирующими активационную систему CRISPR/Cas9-SAM с повышенной экспрессией генов pglyrp. Мы показали, что активация экспрессии генов собственных пептидогликан-распознающих белков человека в линии клеток HeLa приводит к ингибированию развития хламидийной инфекции. Предложенный подход позволяет использовать возможности врожденного иммунитета для борьбы с инфекционными заболеваниями, вызываемыми грампо­ложительными и грамотри­цательными бактериями.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 20-15-00270).

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Prestinaci, F., Pezzotti, P., and Pantosti, A. (2015) Antimicrobial resistance: a global multifaceted phenomenon, Pathog. Glob. Health, 109, 309-318, doi: 10.1179/2047773215y.0000000030.

2. Grill, M. F., and Maganti, R. K. (2011) Neurotoxic effects associated with antibiotic use: management considerations, Br. J. Clin. Pharmacol., 72, 381-393, doi: 10.1111/j.1365-2125.2011.03991.x.

3. Roberts, M. C. (2002) Antibiotic toxicity, interactions and resistance development, Periodontol. 2000, 28, 280-297, doi: 10.1034/j.1600-0757.2002.280112.x.

4. Liu, C., Xu, Z., Gupta, D., and Dziarski, R. (2001) Pepti-doglycan recognition proteins: a novel family of four human innate immunity pattern recognition molecules, J. Biol. Chem., 276, 34686-34694, doi: 10.1074/jbc.M105566200.

5. Kashyap, D. R., Wang, M., Liu, L. H., Boons, G. J., Gupta, D., and Dziarski, R. (2011) Peptidoglycan recognition proteins kill bacteria by activating protein-sensing two-component systems, Nat. Med., 17, 676-683, doi: 10.1038/nm.2357.

6. Sharma, P., Dube, D., Singh, A., Mishra, B., Singh, N., et al. (2011) Structural basis of recognition of pathogen-associated molecular patterns and inhibition of proinflammatory cytokines by camel peptidoglycan recognition protein, J. Biol. Chem., 286, 16208-16217, doi: 10.1074/jbc.M111.228163.

7. Tydell, C. C., Yuan, J., Tran, P., and Selsted, M. E. (2006) Bovine peptidoglycan recognition protein-S: antimicrobial activity, localization, secretion, and binding properties., J. Immunol., 176, 1154-1162, doi: 10.4049/jimmunol.176.2.1154.

8. Hyyryläinen, H. L., Bolhuis, A., Darmon, E., Muukkonen, L., Koski, P., Vitikainen, M., Sarvas, M., Prágai, Z., Bron, S., van Dijl, J. M., and Kontinen, V. P. (2001) A novel two-component regulatory system in Bacillus subtilis for the survival of severe secretion stress, Mol. Microbiol., 41, 1159-1172, doi: 10.1046/j.1365-2958.2001.02576.x.

9. Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Wierzbowski, J., Cottarel, G., and Collins, J. J. (2008) Mistranslation of membrane proteins and two-component system activation trigger antibiotic-mediated cell death, Cell, 135, 679-690, doi: 10.1016/j.cell.2008.09.038.

10. Darmon, E., Noone, D., Masson, A., Bron, S., Kuipers, O. P., Devine, K. M., and van Dijl, J. M. (2002) A novel class of heat and secretion stress-responsive genes is controlled by the autoregulated CssRS two-component system of Bacillus subtilis, J. Bacteriol., 184, 5661-5671, doi: 10.1128/jb.184.20.5661-5671.2002.

11. Westers, H., Westers, L., Darmon, E., van Dijl, J. M., Quax, W. J., and Zanen, G. (2006) The CssRS two-component regulatory system controls a general secretion stress response in Bacillus subtilis, FEBS J., 273, 3816-3827, doi: 10.1111/j.1742-4658.2006.05389.x.

12. Dziarski, R., Kashyap, D. R., and Gupta, D. (2012) Mammalian peptidoglycan recognition proteins kill bacteria by activating two-component systems and modulate microbiome and inflammation., Microb. Drug Res., 18, 280-285, doi: 10.1089/mdr.2012.0002.

13. Dziarski, R., and Gupta, D. (2006) Mammalian PGRPs: novel antibacterial proteins, Cell. Microbiol., 8, 1059-1069, doi: 10.1111/j.1462-5822.2006.00726.x.

14. O’Connell, C. M., and Ferone, M. E. (2016) Chlamydia trachomatis genital infections, Microb. Cell, 3, 390-403, doi: 10.15698/mic2016.09.525.

15. Kalayoglu, M. V. (2002) Ocular chlamydial infections: pathogenesis and emerging treatment strategies, Curr. Drug Targets Infect. Disord., 2, 85-91, doi: 10.2174/1568005024605918.

16. Moulder, J. W. (1991) Interaction of chlamydiae and host cells in vitro, Microb. Rev., 55, 143-190.

17. Panzetta, M. E., Valdivia, R. H., and Saka, H. A. (2018) Chlamydia persistence: a survival strategy to evade antimicrobial effects in vitro and in vivo, Front. Microbiol., 9, 3101, doi: 10.3389/fmicb.2018.03101.

18. Bobrovsky, P., Manuvera, V., Polina, N., Podgorny, O., Prusakov, K., Govorun, V., and Lazarev, V. (2016) Recombinant human peptidoglycan recognition proteins reveal antichlamydial activity, Infect. Immun., 84, doi: 10.1128/IAI.01495-15.

19. Zhu, M., Miao, B., Zhu, J., Wang, H., and Zhou, Z. (2017) Expression and antimicrobial character of cells transfected with human β-defensin-3 against periodontitis-associated microbiota in vitro, Mol. Med. Rep., 16, 2455-2460, doi: 10.3892/mmr.2017.6913.

20. Zhang, J., Xie, L., Xu, D., Yue, S., Li, Y., Guo, X., and Lai, X. (2017) Targeting expression of antimicrobial peptide CAMA-Syn by adenovirus vector in macrophages inhibits the growth of intracellular bacteria, Gene, 630, 59-67, doi: 10.1016/j.gene.2017.07.079.

21. Ramos-Espinosa, O., Hernández-Bazán, S., Francisco-Cruz, A., Mata-Espinosa, D., Barrios-Payán, J., et al. (2016) Gene therapy based in antimicrobial peptides and proinflammatory cytokine prevents reactivation of experimental latent tuberculosis, Pathog. Dis., 74, doi: 10.1093/femspd/ftw075.

22. Dolgachev, V., Panicker, S., Balijepalli, S., McCandless, L. K., Yin, Y., et al. (2018) Electroporation-mediated delivery of FER gene enhances innate immune response and improves survival in a murine model of pneumonia, Gene Therapy, 25, 359-375, doi: 10.1038/s41434-018-0022-y.

23. Scidmore, M. A. (2005) Cultivation and laboratory maintenance of Chlamydia trachomatis, Curr. Protoc. Microbiol., 11, 11A.11, doi: 10.1002/9780471729259.mc11a01s00.

24. Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., Sanjana, N. E., and Zhang, F. (2017) Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening, Nat. Protoc., 12, 828-863, doi: 10.1038/nprot.2017.016.

25. Haeussler, M., Schönig, K., Eckert, H., Eschstruth, A., Mianné, J., et al. (2016) Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR, Genome Biol., 17, 148, doi: 10.1186/s13059-016-1012-2.

26. Tiscornia, G., Singer, O., and Verma, I. M. (2006) Production and purification of lentiviral vectors, Nat. Protoc., 1, 241-245, doi: 10.1038/nprot.2006.37.

27. Schneider, C. A., Rasband, W. S., and Eliceiri, K. W. (2012) NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis, Nat. Methods, 9, 671-675, doi: 10.1038/nmeth.2089.

28. Pfaffl, M. W. (2001) A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR, Nucleic Acids Res., 29, e45, doi: 10.1093/nar/29.9.e45.

29. Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., and Lin, X. (2013) An improvement of the 2′(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis, Biostat. Bioinform. Biomath., 3, 71-85.

30. Schittek, B., Paulmann, M., Senyürek, I., and Steffen, H. (2008) The role of antimicrobial peptides in human skin and in skin infectious diseases, Infect. Dis. Drug Targets, 8, 135-143, doi: 10.2174/1871526510808030135.

31. Schauber, J., and Gallo, R. L. (2008) Antimicrobial peptides and the skin immune defense system, J. Allergy Clin. Immunol., 122, 261-266, doi: 10.1016/j.jaci.2008.03.027.

32. Huang, G. T., Zhang, H. B., Kim, D., Liu, L., and Ganz, T. (2002) A model for antimicrobial gene therapy: demonstration of human beta-defensin 2 antimicrobial activities in vivo, Hum. gene Ther., 13, 2017-2025, doi: 10.1089/10430340260395875.

33. Joo, H. S., Fu, C. I., and Otto, M. (2016) Bacterial strategies of resistance to antimicrobial peptides, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 371, 20150292, doi: 10.1098/rstb.2015.0292.

34. Lu, X., Wang, M., Qi, J., Wang, H., Li, X., Gupta, D., and Dziarski, R. (2006) Peptidoglycan recognition proteins are a new class of human bactericidal proteins, J. Biol. Chem., 281, 5895-5907, doi: 10.1074/jbc.M511631200.

35. Dimroth, P., Kaim, G., and Matthey, U. (2000) Crucial role of the membrane potential for ATP synthesis by F(1)F(o) ATP synthases, J. Exp. Biol., 203, 51-59.

36. Wang, Z. M., Li, X., Cocklin, R. R., Wang, M., Wang, M., Fukase, K., et al. (2003) Human peptidoglycan recognition protein-L is an N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase, J. Biol. Chem., 278, 49044-49052, doi: 10.1074/jbc.M307758200.

37. Lim, J. H., Kim, M. S., Kim, H. E., Yano, T., Oshima, Y., et al. (2006) Structural basis for preferential recognition of diaminopimelic acid-type peptidoglycan by a subset of peptidoglycan recognition proteins, J. Biol. Chem., 281, 8286-8295, doi: 10.1074/jbc.M513030200.

38. Kashyap, D. R., Kuzma, M., Kowalczyk, D. A., Gupta, D., and Dziarski, R. (2017) Bactericidal peptidoglycan recognition protein induces oxidative stress in Escherichia coli through a block in respiratory chain and increase in central carbon catabolism, Mol. Microbiol., 105, 755-776, doi: 10.1111/mmi.13733.

39. Kashyap, D. R., Rompca, A., Gaballa, A., Helmann, J. D., Chan, J., Chang, C. J., Hozo, I., Gupta, D., and Dziarski, R. (2014) Peptidoglycan recognition proteins kill bacteria by inducing oxidative, thiol, and metal stress, PLoS Pathogens, 10, e1004280, doi: 10.1371/journal.ppat.1004280.

40. Chopra, I., Storey, C., Falla, T. J., and Pearce, J. H. (1998) Antibiotics, peptidoglycan synthesis and genomics: the chlamydial anomaly revisited, Microbiol. (Reading), 144, 2673-2678, doi: 10.1099/00221287-144-10-2673.

41. Stephens, R. S., Kalman, S., Lammel, C., Fan, J., Marathe, R., et al. (1998) Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans: Chlamydia trachomatis, Science, 282, 754-759, doi: 10.1126/science.282.5389.

42. Liechti, G. W., Kuru, E., Hall, E., Kalinda, A., Brun, Y. V., VanNieuwenhze, M., and Maurelli, A. T. (2014) A new metabolic cell-wall labelling method reveals peptidoglycan in Chlamydia trachomatis, Nature, 506, 507-510, doi: 10.1038/nature12892.

43. Koo, I. C., and Stephens, R. S. (2003) A developmentally regulated two-component signal transduction system in Chlamydia, J. Biol. Chem., 278, 17314-17319, doi: 10.1074/jbc.M212170200.

44. Witkin, S. S., Minis, E., Athanasiou, A., Leizer, J., and Linhares, I. M. (2017) Chlamydia trachomatis: the persistent pathogen, Clin. Vaccine Immunol., 24, doi: 10.1128/cvi.00203-17.

45. Bobrovsky, P. A., Larin, A. K., Polina, N. F., and Lazarev, V. N. (2019) Transcriptional analysis of HELA cells – producers of the recombinant peptidoglycan recognition protein PGLYRP1 at different stages of the Chlamydia trachomatis infection development, Biomed. Chem. Res. Methods, 2, e00113, doi: 10.18097/BMCRM00113.

46. De Wulf, P., Kwon, O., and Lin, E. C. (1999) The CpxRA signal transduction system of Escherichia coli: growth-related autoactivation and control of unanticipated target operons, J. Bacteriol., 181, 6772-6778.

47. Deller, M. C., Kong, L., and Rupp, B. (2016) Protein stability: a crystallographer’s perspective, Acta Crystallogr. F Struct. Biol. Commun., 72, 72-95, doi: 10.1107/s2053230x15024619.

48. Muheem, A., Shakeel, F., Jahangir, M. A., Anwar, M., Mallick, N., Jain, G. K., Warsi, M. H., and Ahmad, F. J. (2016) A review on the strategies for oral delivery of proteins and peptides and their clinical perspectives, Saudi Pharm. J., 24, 413-428, doi: 10.1016/j.jsps.2014.06.004.

49. O’Neill, L. A., Bryant, C. E., and Doyle, S. L. (2009) Therapeutic targeting of toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer, Pharmacol. Rev., 61, 177-197, doi: 10.1124/pr.109.001073.

50. Sierra-Delgado, J. A., Bautista-Nino, P. K., Vargas-Castellanos, C. I., Serrano Diaz, N. C., and Rincon, M. Y. (2019) Immune response and gene therapy with adenoassociated viral vectors, Medicina, 79, 493-501.

51. Bergmann, B., Fei, Y., Jirholt, P., Hu, Z., Bergquist, M., et al. (2020) Pre-treatment with IL2 gene therapy alleviates Staphylococcus aureus arthritis in mice, BMC Infect. Dis., 20, 185, doi: 10.1186/s12879-020-4880-8.

52. Chandler, L. C., Yusuf, I. H., McClements, M. E., Barnard, A. R., MacLaren, R. E., and Xue, K. (2020) Immunomodulatory effects of hydroxychloroquine and chloroquine in viral infections and their potential application in retinal gene therapy, Int. J. Mol. Sci., 21, doi: 10.3390/ijms21144972.

53. Verma, R., Sahu, R., Singh, D. D., and Egbo, T. E. (2019) A CRISPR/Cas9 based polymeric nanoparticles to treat/inhibit microbial infections, Seminars Cell Dev. Biol., 96, 44-52, doi: 10.1016/j.semcdb.2019.04.007.

54. Lazarev, V. N., Polina, N. F., Shkarupeta, M. M., Kostrjukova, E. S., Vassilevski, A. A., Kozlov, S. A., Grishin, E. V., and Govorun, V. M. (2011) Spider venom peptides for gene therapy of Chlamydia infection, Antimicrob. Agents Chemother., 55, 5367-5369, doi: 10.1128/aac.00449-11.

55. Abe, T., Kaname, Y., Wen, X., Tani, H., Moriishi, K., Uematsu, S., Takeuchi, O., Ishii, K. J., Kawai, T., Akira, S., and Matsuura, Y. (2009) Baculovirus induces type I interferon production through toll-like receptor-dependent and -independent pathways in a cell-type-specific manner, J. Virol., 83, 7629-7640, doi: 10.1128/jvi.00679-09.

56. Abe, T., Hemmi, H., Miyamoto, H., Moriishi, K., Tamura, S., Takaku, H., Akira, S., and Matsuura, Y. (2005) Involvement of the toll-like receptor 9 signaling pathway in the induction of innate immunity by baculovirus, J. Virol., 79, 2847-2858, doi: 10.1128/jvi.79.5.2847-2858.2005.

57. Konermann, S., Brigham, M. D., Trevino, A. E., Joung, J., Abudayyeh, O. O., et al. (2015) Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex, Nature, 517, 583-588, doi: 10.1038/nature14136.