БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 9, с. 1305–1320

УДК 577.152.3

Цистеиновая протеаза из семян льна обладает сильным антикоагулянтным, антитромбоцитарным действием и способна растворять тромбы

© 2020 Ш.К.М. Нандиш 1, Дж. Кенгайя 1, Чх. Рамачандрайя 1, Чандрамма 1, А. Шиваия 1, С.М. Сантош 2, Тирунавуккарасу 3, Д. Саннанингая 1*

Department of Studies and Research in Biochemistry and Centre for Bioscience and Innovation, Tumkur University, 572103 Tumkur, India; E-mail: sdevbiochem@gmail.com

Department of Medicinal Biochemistry and Microbiology (IMBM), Uppsala Biomedical Centre, 75237 Uppsala, Sweden

Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Life Sciences, Pondicherry UniversityM, 605014 Pondicherry, Tamil Nadu, IndiaM

Поступила в редакцию 21.03.2020
После доработки 26.05.2020
Принята к публикации 29.05.2020

DOI: 10.31857/S0320972520090109

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: цистеиновая протеаза, антикоагулянт, антитромбоцитарный, нетоксичный.

Аннотация

В настоящем исследовании была выделена, очищена и охарактеризована цистеиновая протеаза из семянльна (FSCP – flax seed cysteine protease), которая обладает выраженными антикоагулянтными и антитромбоцитарными свойствами и способна растворять образовавшиеся сгустки крови. Эта протеаза была очищена до гомогенного состояния с использованием комбинации методов гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Чистота полученного препарата была подтверждена методами SDS-PAGE, RP-HPLC и MALDI-TOF. Согласно результатам SDS-PAGE в восстанавливающих условиях и в отсутствие восстановителей, в препарате FSCP присутствовала одна чётко выраженная белковая полоса с молекулярной массой ~160 кДа. Точное значение молекулярной массы FSCP, установленное с помощью метода масс-спектрометрии MALDI-TOF, оказалось равным 168 кДа. Спектры кругового дихроизма белка FSCP указывают на присутствие в структуре этого белка 25,6% спиральных структур, 25,8% структур типа «поворот» и 48% структур типа «случайный клубок» и на отсутствие бета-складчатой структуры. FSCP гидролизует как казеин, так и желатин с удельной активностью 3,5 и 4,2 ед./мг·мин соответственно. Протеолитическая активность FSCP полностью отменялась при добавлении йодоуксусной кислоты, что позволяет предположить, что FSCP является представителем семейства цистеиновых протеаз. Было обнаружено, что оптимальные значения pH и температуры для протеолитической активности FSCP равны pH 6,0 и 30 °C соответственно. FSCP демонстрировала сильную антикоагулянтную активность как в препаратах обогащённой тромбоцитами плазмы, так и в случае плазмы, бедной тромбоцитами, вызывая удлинение времени образования сгустков от 222 до 1100 с и от 256 до 1210 с соответственно. FSCP вызывал деградацию фибриногена человека и фибриновых сгустков. Конечные продукты деградации фибриногена в результате действия тромбина и FSCP были разными. Более того, FSCP ингибировал агрегацию отмытых тромбоцитов, индуцируемую ADP, эпинефрином, тромбином, коллагеном, арахидоновой кислотой и фактором активации тромбоцитов. Было обнаружено, что FSCP нетоксичное соединение, так как не повреждает мембрану эритроцитов и не вызывает кровоизлияния и отеков у экспериментальных мышей.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Благодарности

D.S. и S.K. выражают благодарность департаменту науки и технологий, правительству Индии, Нью-Дели и группе поддержки развития науки и технологий при правительстве штата Карнатака, Бангалор, за оказанную финансовую поддержку.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Все эксперименты проводились в соответствии с руководствами по этике и были одобрены институциональным комитетом по этике работы с человеком (IHEC-UOM No. 47Res/2014– 15), университет штата Майсур, Майсуру, Индия. Проведение экспериментов над лабораторными животными было разрешено институциональным комитетом по этике работы с лабораторными животными (UOM/IAEC/02/2016), университет штата Майсур, Майсуру, Индия. Работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с руководством комитета по контролю и надзору за экспериментами над животными (CPCSEA – Committee for the purpose of monitoring and supervision of experiments on animals).

Список литературы

1. Tarpila, A., Wennberg, T., and Tarpila, S. (2005) Flaxseed as a functional food, Curr. Top. Nutr. Res., 3, 167-188.

2. Yadav, R. P., Patel, A. K., and Jagannadham, M. V. (2011) Purification and biochemical characterization of a chymotrypsin like serine protease from Euphorbia neriifolia Linn, Process Biochem., 46, 1654-1662.

3. Mahajan, R. T., and Chaudhary, G. M. (2014) Plant latex as vegetable source for milk clotting enzymes and their use in cheese preparation, Int. J. Adv. Res., 2, 1173-1181.

4. Fox, J. W., and Serrano, S. M. (2005) Structural considerations of the snake venom metalloproteinases, key members of the M12 reprolysin family of metalloproteinases, Toxicon, 45, 969-985.

5. Koh, D. C., Armugam, A., and Jeyaseelan, K. (2006) Snake venom components and their applications in biomedicine, Cell. Mol. Life Sci., 63, 3030-3041.

6. Larréché, S., Mion, G., and Goyffon, M. (2008) Haemostasis disorders caused by snake venoms, Ann. Fr. Anesth. Reanim., 27, 302-309.

7. Zhu, Z. G., and Wu, S. G. (1999) Fibrinogenolytic properties of natrahagin (a proteinase from cobra venom) and its effect on human platelet aggregation, Zhongguo Yao Li Xue Bao, 20, 944-947.

8. Kini, R. M., and Evans, H. J. (1991) Inhibition of platelet aggregation by a fibrinogenase from Naja nigricollis venom is independent of fibrinogen degradation, Biochim. Biophys. Acta, 1095, 117-121.

9. Guo, X. X., Zeng, L., and Lee, W. H. (2007) Isolation and cloning of a metalloproteinase from king cobra snake venom, Toxicon, 49, 954-965.

10. Holenarasipur, S. V., Rajesh, R., Brigitte, F., Felix, F., and Bannikuppe, V. S. (2010) “Pergularain E I” – a plant cysteine protease with thrombin-like activity from Pergularia extensa latex, Thromb. Res., 125, e100-e105.

11. Gunter, R., Hans, P. S., and Friedrich, D. P. (2002) Activation and inactivation of human factor X by proteases derived from Ficus carica, Br. J. Haematol., 119, 1042-1051.

12. Eagle, H., and Harris, T. N. (1937) Studies in blood coagulation: The coagulation of blood by proteolytic enzymes (trypsin, papain), J. Gen. Physiol., 20, 543-560.

13. Nandish, M. S. K., Kengaiah, J., Ramachandraiah, C., Shivaiah, A., Chandramma, S., and Girish, K. S. (2018) Anticoagulant, antiplatelet and fibrin clot hydrolyzing activities of flax seed buffer extract, Pharmacogn. Mag., 14, 175-183.

14. Bradford, M. M. (1976) Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 72, 248-54.

15. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685.

16. Leach, B. S., Collawn, J. F., and Fish, W. W. (1980) Behavior of glycol-polypeptides with empirical molecular weight estimation methods in sodium dodecyl sulphate, Biochemistry, 9, 5734-5741, doi: 10.1021/bi00566a011.

17. Satake, M., Murata, Y., and Suzuki, Y. (1963) Studies on snake venoms XIII Chromatographic separation and properties of three proteinases from Agkistrodon halys blomhoffii venom, J. Biochem., 53, 483-497, doi: 10.1093/oxfordjournals.jbchem.a127720.

18. Sowmyashree, G., Bhagyalakshmi, M., Girish, K. S., Kemparaju, K., Rangaiah, S. M., and Jane, H. P. (2015) Jackfruit (Artocarpush eterophyllus) seed extract exhibits fibrino(geno)lytic activity, Pharmacogn. J., 7, 171-177.

19. Quick, A. J., Stanley, M., and Bancroft, F. W. (1935) A study of the coagulation defect in hemophilia and in jaundice, Am. J. Med. Sci., 190, 501-511.

20. Bhagyalakshmi, M., Sowmyashree, G., Kesturu, G. S., Kempaiah, K., and Sathish, J. G. (2015) Momordica charantia seed extract exhibits strong anticoagulant effect by specifically interfering in intrinsic pathway of blood coagulation and dissolves fibrin clot, Blood Coagul. Fibrin., 26, 191-199.

21. Ouyang, C., and Teng, C. M. (1976) Fibrinogenolytic enzymes of Trimeresurus mucrosquamatus venom, Biochim. Biophys. Acta, 420, 298-308.

22. Rajesh, R., Raghavendra, C. D., and Nataraju, A. (2005) Procoagulant activity of Calotropisgigantea latex associated with fibrin(ogen)olytic activity, Toxicon, 46, 84-92.

23. Kumar, M. S., Devaraj, V. R., Vishwanath, V. S., and Kemparaju, K. (2010) Anti-coagulant activity of a metalloprotease: further characterization from the Indian cobra (Najanaja) venom, J. Thromb. Thrombolysis, 29, 340-348.

24. Born, G. V. (1962) Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal, Nature, 194, 27-29.

25. Vishwanath, B. S., Kini, R. M., and Gowda, T. V. (1987) Characterization of three edema-inducing phospholipase A2 enzyme from habu (Trimeresurus flavoviridis) venom and their interaction with the alkaloid arisatolochic acid, Toxicon, 25, 501-515.

26. Kondo, H., Kondo, S., Itezawa, H., Murata, R., and Ohasaka, A. (1969) A study on the quantitative method from determination of hemorrhagic activity of Habu snake venom, Jpn. J. Med. Sci. Biol., 13, 43-51.

27. Ramachandraiah, C., Nandish, S. K. M., Kengaiah, J., Shivaiah, A., and Chandramma, S. (2017) Evaluation of anticoagulant and antiplatelet activity of Pisum sativum Pod extract, J. Blood Res. Hematol. Dis., 2.

28. Lynn, K. R., and Clevette, N. A. (1985) Two proteases from the latex of Euphorbia drupifera, Phytochemistry, 24, 2843-2845.

29. Yadav, S. C., Pande, M., and Jagannadham, M. V. (2006) Highly stable glycosylated serine protease from the medicinal plant Euphorbia milli, Phytochemistry, 67, 1414-1426.

30. Devaraja, S., Nagaraju, S., Mahadeshwara, S. Y. H., Girish, K. S., and Kemparaju, K. (2008) A low molecular weight serine protease: purification and characterization from Hippasa agelenoides (Funnel web) spider venom gland extract, Toxicon, 52, 130-138.

31. Reis, C. V., Portaro, F. C. V., Andrade, A. S., Fritzen, M., Fernandes, B. L., and Sampaio, C. A. M. (2006) A prothrombin activator serine protease from the Lonomia obiqua Caterpillar venom (Lopap): biochemical characterization, Thromb. Res., 102, 427-436.

32. Kumar, R. V., Gowda, C. D., Shivaprasad, H. V., Siddesha, J. M., Sharath, B. K., and Vishwanath, B. S. (2010) Purification and characterization of “Trimarin” a hemorrhagic metalloprotease with factor Xa-like Activity, from Trimeresurus malabaricus snake venom, Thromb. Res., 126, e356-e364.

33. Gowda, C. D., Shivaprasad, H. V., Kumar, R. V., Rajesh, R., Saikumari, Y. K., and Frey, B. M. (2011) Characterization of major zinc containing myonecrotic and Procoagulant metalloprotease “malabarin” from non-lethal trimeresurus malabaricus snake venom with thrombin like activity: its neutralization by chelating agents, Curr. Top. Med. Chem., 11, 2578-2588.

34. Devaraja, S., Girish, K. S., Gowtham, Y. J. M., and Kemparaju, K. (2010) The Hag-protease-II is a fibrin(ogen)ase from Hippasa agelenoides spider venom gland extract: purification, characterization and its role in hemostasis, Toxicon., 57, 248-258.

35. Shivaprasad, H. V., Rajesh, R., Nanda, B. L., Dharmappa, K. K., and Vishwanath, B. S. (2009) Thrombin like activity of Asclepias curassavica L. latex: action of cysteine proteases, J. Ethno Pharmacol., 123, 106-109.

36. Asadi, H., Yan, B., Dowling, R., Wong, S., and Mitchell, P. (2014) Advances in medical revascularisation treatment in acute ischemic stroke, Trombosis, 7, 42-48.

37. Larsson, L. J., Frisch, E. P., Törneke, K., Lindblom, T., and Björk, I. (1988) Properties of the complex between alpha 2-macroglobulin and brinase, a proteinase from Aspergillus oryzae with thrombolytic effect, Thromb. Res., 49, 55-68.

38. Drake, T. A., Morrissey, J. H., and Edgington, T. S. (1989) Selective cellular expression of tissue factor in human tissues. Implications for disorders of hemostasis and thrombosis, Am. J. Pathol., 134, 1087-1097.

39. Åstrup, T. (1958) The haemostatic balance, Thromb. Diath. Haemorrh., 2, 347-357.

40. Lu, Q. (2005) Snake venoms and haemostasis, J. Thromb. Hemostat., 3, 1791-1799.

41. Shivaprasad, H. V., Riyaz, M., Venkatesh, K. R., Dharmappa, K. K., Tarannum, S., and Siddesha, J. M. (2009) Cysteine proteases from the Asclepiadaceae plants latex exhibited thrombin and plasmin like activities, J. Thromb. Thrombolysis, 28, 304-308.

42. Veiga, S. S., da-Sliveria, R. R., Dreyfuss, J. L., Haoach, J., Pereira, A. M., and Mangili, O. C. (2000) Identification of high molecular weight serine proteases in Loxosceles intermedia (Brown spider) venom, Toxicon, 38, 825-839.

43. Schwartz, M. L., Pizzo, S. V., Hill, R. L., and McKee, P. A. (1973) Human factor XIII from plasma and platelets: molecular weights, subunit structures, proteolytic activation and cross-linking of fibrinogen and fibrin, J. Biol. Chem., 248, 1395-1407.

44. Lewis, S. D., Janus, T. J., Lorand, L., and Shafer, J. A. (1985) Regulation of formation of factor XIIIa by its fibrin substrates, Biochemistry, 24, 6772-6777.

45. Rajesh, R., Nataraju, A., Raghavendra, C. D., Frey, B. M., Frey, F. J., and Vishwanath, B. S. (2006) Purification and characterization of a 34-kDa, heat stable glycoprotein from Synadenium grantii latex: action on human fibrinogen and fibrin clot, Biochimie, 88, 1313-1322.

46. Kahn, M. L. (1998) A dual thrombin receptor system for platelet activation, Nature, 394, 690-694.

47. Sims, P. J., Wiedmer, T., Esmon, C. T., Weiss, H. J., and Shattil, S. J. (1989) Assembly of the platelet prothrombinase complex is linked to vesiculation of the platelet plasma membrane, J. Biol. Chem., 264, 17049-17057.

48. Giesen, P. L. (1999) Blood-borne tissue factor: another view of thrombosis, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 96, 2311-2315.

49. Marulasiddeshwara, M. B., Dakshayani, S. S., Sharath, K. M. N., Chethana, R., Raghavendra, K. P., and Devaraja, S. (2017) Facile-one pot-green synthesis, antibacterial, antifungal, antioxidant and antiplatelet activities of lignin capped silver nanoparticles: a promising therapeutic agent, Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl., 81, 182-190, doi: 10.1016/j.msec.2017.07.054.

50. Cunha, R. B., Barbaro, K. C., Muramatsu, D., Portaro, F. C. V., Fontes, W., and de-Souza, M. V. (2003) Purification and characterization of Loxnecrogin a dermonecrotic toxin from Loxosceles gaucho Brown spider venom, J. Protein Chem., 22, 135-146.