БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 7, с. 929–939

УДК 577.214

Роль контактов CRE-района РНК-полимеразы Escherichia coli с нематричной цепью ДНК в процессе ухода с промотора*

© 2020 И.В. Петушков **, А.В. Кульбачинский

Институт молекулярной генетики Российской академии наук, 123182 Москва, Россия; электронная почта: telomer1@rambler.ru

Поступила в редакцию 07.05.2020
После доработки 09.06.2020
Принята к публикации 10.06.2020

DOI: 10.31857/S0320972520070076

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: РНК-полимераза, CRE-карман, промотор, уход с промотора.

Аннотация

РНК-полимераза (РНКП) узнает последовательность промоторной ДНК благодаря множеству взаимодействий, которые обеспечивают специфичность инициации транскрипции. У бактерий, кроме главного фактора инициации – σ-субъединицы, – в узнавании промоторов может принимать участие кор-фермент РНКП. В частности, остаток гуанина в +2 положении (+2G) нематричной цепи ДНК размещается в CRE-кармане (core recognition element), сформированном β-субъединицей РНКП. Целью нашего исследования являлось изучение роли данных контактов в процессе ухода РНКП с промотора. В работе исследованы точечные мутации в β-субъединице РНКП Escherichia coli, которые нарушают описанные взаимодействия. Мы установили, что наличие в составе промотора остатка +2G приводит к замедлению скорости ухода с промотора и увеличению доли неактивных комплексов. Аминокислотные замены в CRE-кармане снижают стабильность промоторных комплексов и изменяют картину коротких РНК-продуктов, синтезируемых в процессе инициации, но не оказывают значительного влияния на скорость перехода к элонгации независимо от наличия остатка +2G. Таким образом, контакты CRE-кармана с +2G не вносят существенного вклада в кинетику ухода РНКП с промотора, а наблюдаемые изменения в эффективности абортивного синтеза не связаны напрямую со скоростью перехода к элонгации транскрипции.

Сноски

* Первоначально английский вариант рукописи опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM20-117, 29.06.2020.

** Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 17-14-01393).

Благодарности

Авторы благодарят И. Арцимович за предоставленные плазмиды.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания выполненных авторами исследований с участием людей или использованием животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., and Gross, C. A. (2014) Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective, Annu. Rev. Microbiol., 68, 357-376, doi: 10.1146/annurev-micro-092412-155737.

2. Zhang, Y., Feng, Y., Chatterjee, S., Tuske, S., Ho, M. X., Arnold, E., and Ebright, R. H. (2012) Structural basis of transcription initiation, Science, 338, 1076-1080, doi: 10.1126/science.1227786.

3. Basu, R. S., Warner, B. A., Molodtsov, V., Pupov, D., Esyunina, D., Fernandez-Tornero, C., Kulbachinskiy, A., and Murakami, K. S. (2014) Structural basis of transcription initiation by bacterial RNA polymerase holoenzyme, J. Biol. Chem., 289, 24549-24559, doi: 10.1074/jbc.M114.584037.

4. Zuo, Y., and Steitz, T. A. (2015) Crystal structures of the E. coli transcription initiation complexes with a complete bubble, Mol. Cell, 58, 534-540, doi: 10.1016/j.molcel.2015.03.010.

5. Mitchell, J. E., Zheng, D., Busby, S. J., and Minchin, S. D. (2003) Identification and analysis of “extended –10” promoters in Escherichia coli, Nucleic Acids Res., 31, 4689-4695, doi: 10.1093/nar/gkg694.

6. Vvedenskaya, I. O., Vahedian-Movahed, H., Zhang, Y., Taylor, D. M., Ebright, R. H., and Nickels, B. E. (2016) Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 113, E2899-E2905, doi: 10.1073/pnas.1603271113.

7. Kulbachinskiy, A., and Mustaev, A. (2006) Region 3.2 of the sigma subunit contributes to the binding of the 3′-initiating nucleotide in the RNA polymerase active center and facilitates promoter clearance during initiation, J. Biol. Chem., 281, 18273-18276, doi: 10.1074/jbc.C600060200.

8. Pupov, D., Kuzin, I., Bass, I., and Kulbachinskiy, A. (2014) Distinct functions of the RNA polymerase sigma subunit region 3.2 in RNA priming and prom oter escape, Nucleic Acids Res., 42, 4494-4504, doi: 10.1093/nar/gkt1384.

9. Duchi, D., Bauer, D. L., Fernandez, L., Evans, G., Robb, N., Hwang, L. C., Gryte, K., Tomescu, A., Zawadzki, P., Morichaud, Z., Brodolin, K., and Kapanidis, A. N. (2016) RNA polymerase pausing during Initial transcription, Mol. Cell, 63, 939-950, doi: 10.1016/j.molcel.2016.08.011.

10. Dulin, D., Bauer, D. L. V., Malinen, A. M., Bakermans, J. J. W., Kaller, M., Morichaud, Z., Petushkov, I., Depken, M., Brodolin, K., Kulbachinskiy, A., and Kapanidis, A. N. (2018) Pausing controls branching between productive and non-productive pathways during initial transcription in bacteria, Nat. Commun., 9, 1478, doi: 10.1038/s41467-018-03902-9.

11. Vvedenskaya, I. O., Vahedian-Movahed, H., Bird, J. G., Knoblauch, J. G., Goldman, S. R., Zhang, Y., Ebright, R. H., and Nickels, B. E. (2014) Transcription. Interactions between RNA polymerase and the “core recognition element” counteract pausing, Science, 344, 1285-1289, doi: 10.1126/science.1253458.

12. Petushkov, I., Pupov, D., Bass, I., and Kulbachinskiy, A. (2015) Mutations in the CRE pocket of bacterial RNA polymerase affect multiple steps of transcription, Nucleic Acids Res., 43, 5798-5809, doi: 10.1093/nar/gkv504.

13. Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O., and Buck, M. (2013) An aromatic residue switch in enhancer-dependent bacterial RNA polymerase controls transcription intermediate complex activity, Nucleic Acids Res., 41, 5874-5886, doi: 10.1093/nar/gkt271.

14. Mekler, V., Kortkhonjia, E., Mukhopadhyay, J., Knight, J., Revyakin, A., Kapanidis, A. N., Niu, W., Ebright, Y. W., Levy, R., and Ebright, R. H. (2002) Structural organization of bacterial RNA polymerase holoenzyme and the RNA polymerase-promoter open complex, Cell, 108, 599-614.

15. Straney, D. C., and Crothers, D. M. (1987) A stressed intermediate in the formation of stably initiated RNA chains at the Escherichia coli lac UV5 promoter, J. Mol. Biol., 193, 267-278, doi: 10.1016/0022-2836(87)90218-x.

16. Kapanidis, A. N., Margeat, E., Ho, S. O., Kortkhonjia, E., Weiss, S., and Ebright, R. H. (2006) Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism, Science, 314, 1144-1147, doi: 10.1126/science.1131399.

17. Revyakin, A., Liu, C., Ebright, R. H., and Strick, T. R. (2006) Abortive initiation and productive initiation by RNA polymerase involve DNA scrunching, Science, 314, 1139-1143, doi: 10.1126/science.1131398.

18. Henderson, K. L., Felth, L. C., Molzahn, C. M., Shkel, I., Wang, S., Chhabra, M., Ruff, E. F., Bieter, L., Kraft, J. E., and Record, M. T., Jr. (2017) Mechanism of transcription initiation and promoter escape by E. coli RNA polymerase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 114, E3032-E3040, doi: 10.1073/pnas.1618675114.

19. Winkelman, J. T., and Gourse, R. L. (2017) Open complex DNA scrunching: a key to transcription start site selection and promoter escape, BioEssays, 39, doi: 10.1002/bies.201600193.

20. Carpousis, A. J., and Gralla, J. D. (1985) Interaction of RNA polymerase with lacUV5 promoter DNA during mRNA initiation and elongation. Footprinting, methylation, and rifampicin-sensitivity changes accompanying transcription initiation, J. Mol. Biol., 183, 165-177, doi: 10.1016/0022-2836(85)90210-4.

21. Ko, J., and Heyduk, T. (2014) Kinetics of promoter escape by bacterial RNA polymerase: effects of promoter contacts and transcription bubble collapse, Biochem. J., 463, 135-144, doi: 10.1042/BJ20140179.

22. Samanta, S., and Martin, C. T. (2013) Insights into the mechanism of initial transcription in Escherichia coli RNA polymerase, J. Biol. Chem., 288, 31993-32003, doi: 10.1074/jbc.M113.497669.

23. Murakami, K. S., Masuda, S., and Darst, S. A. (2002) Structural basis of transcription initiation: RNA polymerase holoenzyme at 4 A resolution, Science, 296, 1280-1284., doi: 10.1126/science.1069594.

24. Li, L., Molodtsov, V., Lin, W., Ebright, R. H., and Zhang, Y. (2020) RNA extension drives a stepwise displacement of an initiation-factor structural module in initial transcription, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 117, 5801-5809, doi: 10.1073/pnas.1920747117.

25. Petushkov, I., Esyunina, D., Mekler, V., Severinov, K., Pupov, D., and Kulbachinskiy, A. (2017) Interplay between sigma region 3.2 and secondary channel factors during promoter escape by bacterial RNA polymerase, Biochem. J., 474, 4053-4064, doi: 10.1042/BCJ20170436.

26. Kammerer, W., Deuschle, U., Gentz, R., and Bujard, H. (1986) Functional dissection of Escherichia coli promoters: information in the transcribed region is involved in late steps of the overall process, EMBO J., 5, 2995-3000.

27. Hsu, L. M., Cobb, I. M., Ozmore, J. R., Khoo, M., Nahm, G., Xia, L., Bao, Y., and Ahn, C. (2006) Initial transcribed sequence mutations specifically affect promoter escape properties, Biochemistry, 45, 8841-8854, doi: 10.1021/bi060247u.

28. Hsu, L. M. (2002) Promoter clearance and escape in prokaryotes, Biochim. Biophys. Acta, 1577, 191-207, doi: 10.1016/s0167-4781(02)00452-9.

29. Hsu, L. M. (2009) Monitoring abortive initiation, Methods, 47, 25-36, doi: 10.1016/j.ymeth.2008.10.010.

30. Vo, N. V., Hsu, L. M., Kane, C. M., and Chamberlin, M. J. (2003) In vitro studies of transcript initiation by Escherichia coli RNA polymerase. 3. Influences of individual DNA elements within the promoter recognition region on abortive initiation and promoter escape, Biochemistry, 42, 3798-3811, doi: 10.1021/bi026962v.

31. Heyduk, E., and Heyduk, T. (2018) DNA template sequence control of bacterial RNA polymerase escape from the promoter, Nucleic Acids Res., 46, 4469-4486, doi: 10.1093/nar/gky172.

32. Lerner, E., Chung, S., Allen, B. L., Wang, S., Lee, J., Lu, S. W., Grimaud, L. W., Ingargiola, A., Michalet, X., Alhadid, Y., Borukhov, S., Strick, T. R., Taatjes, D. J., and Weiss, S. (2016) Backtracked and paused transcription initiation intermediate of Escherichia coli RNA polymerase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 113, E6562-E6571, doi: 10.1073/pnas.1605038113.

33. Mekler, V., Pavlova, O., and Severinov, K. (2011) The interaction of E. coli RNA polymerase σ70 subunit with promoter elements in the context of free σ70, RNA polymerase holoenzyme and the β′–σ70 complex., J. Biol. Chem., 286, 270-279, doi: 10.1074/jbc.M110.174102.

34. Mekler, V., and Severinov, K. (2015) Use of RNA polymerase molecular beacon assay to measure RNA polymerase interactions with model promoter fragments, Methods Mol. Biol., 1276, 199-210, doi: 10.1007/978-1-4939-2392-2_11.

35. Svetlov, V., and Artsimovitch, I. (2015) Purification of bacterial RNA polymerase: tools and protocols, Methods Mol. Biol., 1276, 13-29, doi: 10.1007/978-1-4939-2392-2_2.

36. Petushkov, I., Esyunina, D., and Kulbachinskiy, A. (2017) σ38-dependent promoter-proximal pausing by bacterial RNA polymerase, Nucleic Acids Res., 45, 3006-3016, doi: 10.1093/nar/gkw1213.

37. Pupov, D., Petushkov, I., Esyunina, D., Murakami, K. S., and Kulbachinskiy, A. (2018) Region 3.2 of the σ factor controls the stability of rRNA promoter complexes and potentiates their repression by DksA, Nucleic Acids Res., 46, 11477-11487, doi: 10.1093/nar/gky919.

38. Pupov, D., Esyunina, D., Feklistov, A., and Kulbachinskiy, A. (2013) Single-strand promoter traps for bacterial RNA polymerase, Biochem. J., 452, 241-248, doi: 10.1042/BJ20130069.

39. Pupov, D., Miropolskaya, N., Sevostyanova, A., Bass, I., Artsimovitch, I., and Kulbachinskiy, A. (2010) Multiple roles of the RNA polymerase β′ SW2 region in transcription initiation, promoter escape, and RNA elongation, Nucleic Acids Res., 38, 5784-5796, doi: 10.1093/nar/gkq355.

40. Mekler, V., Minakhin, L., Kuznedelov, K., Mukhamedyarov, D., and Severinov, K. (2012) RNA polymerase–promoter interactions determining different stability of the Escherichia coli and Thermus aquaticus transcription initiation complexes, Nucleic Acids Res., 40, 11352-11362, doi: 10.1093/nar/gks973.

41. Mekler, V., Minakhin, L., and Severinov, K. (2011) A critical role of downstream RNA polymerase-promoter interactions in the formation of initiation complex,J. Biol. Chem., 286, 22600-22608, doi: 10.1074/jbc.M111.247080.

42. Sugimoto, N., Nakano, S., Katoh, M., Matsumura, A., Nakamuta, H., Ohmichi, T., Yoneyama, M., and Sasaki, M. (1995) Thermodynamic parameters to predict stability of RNA/DNA hybrid duplexes, Biochemistry, 34, 11211-11216, doi: 10.1021/bi00035a029.