БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 7, с. 916–928

УДК 577.1

Идентификация гена химозина алтайского марала [Cervus Elaphus Sibiricus (Severtzov, 1873)], наработка его рекомбинантного аналога в прокариотической системе экспрессии и анализ некоторых биохимических свойств полученного фермента*

© 2020 С.В. Беленькая 1,2**, А.А. Бондарь 3, Т.А. Кургина 2,3, В.В. Ельчанинов 4, А.Ю. Бакулина 1,2, Е.А. Рухлова 2, О.И. Лаврик 3, А.А. Ильичев 1, Д.Н. Щербаков 1,5

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, 630559 р.п. Кольцово, Новосибирская обл., Россия; электронная почта: belenkaya.sveta@gmail.com

Новосибирский государственный университет, 630090 Новосибирск, Россия

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090 Новосибирск, Россия

Федеральный Алтайский научный центр агробиотехнологий, Сибирский НИИ сыроделия, 656910 Барнаул, Россия

Алтайский государственный университет, 656049 Барнаул, Россия

Поступила в редакцию 05.05.2020
После доработки 05.05.2020
Принята к публикации 19.05.2020

DOI: 10.31857/S0320972520070064

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: рекомбинантный химозин, марал, молокосвертывающая активность, термостабильность, параметры кинетики Михаэлиса–Ментен.

Аннотация

Впервые идентифицирован ген химозина (CYM) алтайского марала (далее – марала). С помощью сравнительного анализа нуклеотидной последовательности установлена его экзон/интронная организация и реконструирована последовательность мРНК CYM, кодирующая препрохимозин марала. На основе нуклеотидной последовательности мРНК CYM марала разработан экспрессионный вектор, обеспечивающий наработку рекомбинантного фермента. Рекомбинантный прохимозин (рПроХн) марала получен в системе экспрессии Escherichia coli (штамм BL21(DE3)). Общая молокосвертывающая активность (МА) рекомбинантного химозина марала (рХн Cer) составила 2330 УЕ/мл, удельная активность равнялась 52 955 УЕ/мг. В диапазоне температур 30–50 °С рХн Cer проявлял 100–81% МА, порог термостабильности составил 50 °С, при 70 С фермент полностью инактивировался. В качестве образцов сравнения использовали препараты рекомбинантного химозина одногорбого верблюда (рХн Cam) и рекомбинантного химозина коровы (рХн Bos). Константа Михаэлиса (Km), число оборотов фермента (kcat) и каталитическая эффективность (kcat / Km) для рХн Cer составили 1,18 ± 0,1 мкМ, 2,68 ± 0,08 с-1 и 2,27 ± 0,10 мкM-1·с-1 соответственно.

Сноски

* Первоначально английский вариант рукописи опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow) , в рубрике «Papers in Press», BM20-113, 24.06.2020.

** Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования РФ (номер темы FZMW-2020-0002, «Разработка продуцентов рекомбинантных ферментов для сыроделия»).

Благодарности

Секвенирование ДНК было выполнено в ЦКП «Геномика» ИХБФМ СО РАН.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.

Соблюдение этических норм

Все применяемые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Дополнительные материалы

Приложение к статье на английском языке опубликовано на сайте журнала «Biochemistry» (Moscow) (http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya/) и на сайте издательства Springer (https://link.springer.com/journal/10541), том 85, вып. 7, 2020.

Список литературы

1. Harboe, M., Broe, M. L., and Qvist, K. B. (2010) The production, action and application of rennet and coagulants, in Technology of Cheesemaking, 2, 98-129.

2. Белов А. Н., Коваль А. Д., Авданина Е. А., Ельчанинов В. В. (2009) Влияние молокосвертывающего препарата на органолептические показатели сыра, Сыроделие Маслоделие, 1, 22-24.

3. Jacob, M., Jaros, D., and Rohm, H. (2011) Recent advances in milk clotting enzymes, Int. J. Dairy Technol., 64, 14-33.

4. Feijoo-Siota, L., Blasco, L., Luis Rodriguez-Rama, J., Barros-Velázquez, J., de Miguel, T., Sánchez-Pérez, A., and G Villa, T. (2014) Recent patents on microbial proteases for the dairy industry, Recent Adv. DNA Gene Seq., 8, 44-55.

5. Kimberlin, R. H. (1996). Bovine spongiform encephalopathy and public health: some problems and solutions in assessing the risk, in 3rd International Symposium on Transmissible Subacute Spongiform Encephalopathies: Prion Diseases, Paris (Court, L., and Dodet, B., eds.) Amsterdam, Elsevier, pp. 487-502.

6. Lebedev, L. R., Kosogova, T. A., Teplyakova, T. V., Kriger, A. V., Elchaninov, V. V., Belov, A. N., and Koval, A. D. (2016). Study of technological properties of milk-clotting enzyme from Irpex lacteus (Irpex lacteus (fr.) fr.), Foods Raw Mater., 4, 58-65.

7. Ельчанинов В. В. (2006) Молокосвертывающий фермент из сычугов северного оленя, Сыроделие и маслоделие, 4, 42-44.

8. Ельчанинов В. В. (2006) Исследование молокосвертывающего фермента из сычугов северных оленей, Дисс. канд. техн. наук, Кемеров. Технол. Ин-т Пищевой Пром., Кемерово, стр. 121-147.

9. Uchiyama, H., Uozumi, T., Beppu, T., and Arima, K. (1980) Purification of prorennin mRNA and its translation in vitro, Agricult. Biol. Chem., 44, 1373-1381.

10. Flamm, E. L. (1991) How FDA approved chymosin: a case history, Biotechnology, 9, 349.

11. Pungercar, J., Strukelj, B., Gubensek, F., Turk, V., and Kregar, I. (1990) Complete primary structure of lamb preprochymosin deduced from cDNA, Nucleic Acids Res., 18, 4602.

12. Rogelj, I., Perko, B., Francky, A., Penca, V., and Pungerčar, J. (2001). Recombinant lamb chymosin as an alternative coagulating enzyme in cheese production, J. Dairy Sci., 84, 1020-1026.

13. Vega-Hernández, M. C., Gómez-Coello, A., Villar, J., and Claverie-Martı́n, F. (2004) Molecular cloning and expression in yeast of caprine prochymosin, J. Biotechnol., 114, 69-79.

14. Eskandari, M. H., Hosseini, A., and Aminlari, M. (2008) Nucleotide sequence of cDNA encoding for preprochymosin in native goat (Capra hircus) from Iran, Iranian J. Veterinary Res., 9, 262-265.

15. Kappeler, S., Farah, Z., van den Brink, J. M., Rahbek-Nielsen, H., and Budtz, P. (2016) U.S. Patent No. 9,307,775, Washington, DC: U.S. Patent and Trademark Office.

16. Kappeler, S. R., Rahbek-Nielsen, H., Farah, Z., Puhan, Z., Hansen, E. B., and Johansen, E. (2006) Characteriz-ation of recombinant camel chymosin reveals superior properties for the coagulation of bovine and camel milk, Biochem. Biophys. Res. Commun., 342, 647-654.

17. Ersöz, F., and İnan, M. (2019) Large-scale production of yak (Bos grunniens) chymosin A in Pichia pastoris, Protein Expr. Purif., 154, 126-133.

18. Luo, F., Jiang, W. H., Yang, Y. X., Li, J., and Jiang, M. F. (2016) Cloning and expression of yak active chymosin in Pichia pastoris, Asian-Australas. J. Anim. Sci., 29, 1363.

19. Vallejo, J. A., Ageitos, J. M., Poza, M., and Villa, T. G. (2008). Cloning and expression of buffalo active chymosin in Pichia pastoris, J. Agric. Food Chem., 56, 10606-10610.

20. Беленькая С. В., Рудометов А. П., Щербаков Д. Н., Балабова Д. В., Кригер А. В., Белов А. Н., Коваль А. Д., Ельчанинов В. В. (2018) Некоторые биохимические свойства рекомбинантного химозина альпака (Vicugna pacos L.), Прикл. Биохим. Микробиол., 54, 585-593.

21. Vallejo, J. A., Ageitos, J. M., Poza, M., and Villa, T. G. (2012) A comparative analysis of recombinant chymosins, J. Dairy Sci., 95, 609-613.

22. Bansal, N., Drake, M. A., Piraino, P., Broe, M. L., Harboe, M., Fox, P. F., and McSweeney, P. L. H. (2009) Suitability of recombinant camel (Camelus dromedarius) chymosin as a coagulant for Cheddar cheese, Int. Dairy J., 19, 510-517.

23. Wei, C., Tang, B., Zhang, Y., and Yang, K. (1999) Oxidative refolding of recombinant prochymosin, Biochem. J., 340, 345.

24. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680.

25. Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 72, 248-254.

26. Рудометов А. П., Беленькая С. В., Щербаков Д. Н., Балабова Д. В., Кригер А. В., Ельчанинов В. В. (2017) Исследование ферментативной стабильности жидких препаратов рекомбинантного химозина коровы (Bos taurus taurus L.), Сыроделие и маслоделие, 6, 40-43.

27. Hall, T. A. (1999) BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT, in Nucleic Acids Symposium Series, Information Retrieval Ltd., Vol. 41, pp. 95-98.

28. Waterhouse, A., Bertoni, M., Bienert, S., Studer, G., Tauriello, G., Gumienny, R., and Lepore, R. (2018) SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes, Nucleic Acids Res., 46, W296-W303.

29. Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., and Ferrin, T. E. (2004) UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis, J. Comput. Chem., 25, 1605-1612.

30. Johnson, K. A., and Goody, R. S. (2011) The original Michaelis constant: translation of the 1913 Michaelis– Menten paper, Biochemistry, 50, 8264-8269.

31. Naidu, A., Fitak, R. R., Munguia-Vega, A., and Culver, M. (2011) Novel primers for complete mitochondrial cyto-chrome b gene sequencing in mammals, Mol. Ecol. Res., 12, 191-196.

32. Павлинов И. Я. (2006) Систематика современных млекопитающих, Московский гос. Университет, Москва.

33. Щербаков Д. Н., Рудометов А. П., Ельчанинов В. В., Беленькая С. В., Кригер А. В., Ильичев А. А. (2006) Рекомбинантная плазмида pET21a-ProChym, обеспечивающая синтез химерного белка прохимозина B Bos Taurus, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysE pET21a-ProChym – продуцент химерного белка прохимозина B Bos Taurus., Патент РФ на изобретение № 2670071, СПК C12N 9/6483 (2006.01); C12N 15/64 (2006.01); C12N 15/70 (2006.01); C12Y 304/23004 (2006.01).

34. Pedersen, V. B., Christensen, K. A., and Foltmann, B. (1979) Investigations on the activation of bovine prochymosin, Eur. J. Biochem., 94, 573-580.

35. Wang, N., Wang, K. Y., Li, G., Guo, W., and Liu, D. (2015) Expression and characterization of camel chymosin in Pichia pastoris, Protein Expr. Purif., 111, 75-81.

36. Jiang, X. P., Yin, M. L., Chen, P., and Yang, Q. (2012) Constitutive expression, purification and characterization of bovine prochymosin in Pichia pastoris GS115, World J. Microbiol. Biotechnol., 28, 2087-2093.

37. Noseda, D. G., Recúpero, M. N., Blasco, M., Ortiz, G. E., and Galvagno, M. A. (2013) Cloning, expression and optimized production in a bioreactor of bovine chymosin B in Pichia (Komagataella) pastoris under AOX1 pro-moter, Protein Expr. Purif., 9, 235-244.

38. Jensen, J. L., Mølgaard, A., Navarro Poulsen, J. C., Harboe, M. K., Simonsen, J. B., Lorentzen, A. M., and Larsen, S. (2013) Camel and bovine chymosin: the relationship between their structures and cheese-making properties, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr., 69, 901-913.

39. Jensen, J. L., Jacobsen, J., Moss, M. L., Rasmussen, F., Qvist, K. B., Larsen, S., and van den Brink, J. M. (2015) The function of the milk-clotting enzymes bovine and camel chymosin studied by a fluorescence resonance energy transfer assay, J. Dairy Sci., 98, 2853-2860.

40. Zhou, X. X., Wang, Y. B., Pan, Y. J., and Li, W. F. (2008). Differences in amino acids composition and coupling patterns between mesophilic and thermophilic proteins, Amino Acids, 34, 25-33.

41. Бобкова Е. В., Гедрович А. В., Анкилова В. Н., Лаврик О. И., Баратова Л. А., Шишков А. В. (1990) Сравнительное исследование фенилаланил-тРНК-синтетаз из Escherichia coli и Thermus thermophilus методом тритиевой топографии, Биохимия, 55, 1570-1577.