БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 5, с. 672–681

УДК 577.151.03

Влияние положения последовательности HIS6 на экспрессию и свойства фенилацетонмонооксигеназы из Thermobifida fusca*

© 2020 П.Д. Паршин 1,2, А.А. Пометун 1,2,3**, У.А. Мартысюк 4, С.Ю. Клейменов 3,5, Д.Л. Атрошенко 1,2,3, Е.В. Пометун 6, С.С. Савин 1,2,3, В.И. Тишков 1,2,3**

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991 Москва, Россия; электронная почта: aapometun@gmail.com; vitishkov@gmail.com

ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», 109551 Москва, Россия

Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, 119071 Москва, Россия

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, 125047 Москва, Россия

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, Россия

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), 119991 Москва, Россия

Поступила в редакцию 23.03.2020
После доработки 27.03.2020
Принята к публикации 27.03.2020

DOI: 10.31857/S0320972520050061

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: фенилацетонмонооксигеназа, His-tag, экспрессия, каталитические свойства, термостабильность, дифференциальная сканирующая калориметрия.

Аннотация

Фенилацетонмонооксигеназа (КФ 1.14.13.92, РАМО) – фермент, катализирующий реакцию окисления кетонов до сложных эфиров с использованием молекулярного кислорода и NADPH. РАМО является перспективным ферментом для использования в биотехнологических процессах. Нами получены генетические конструкции с геном PAMO из Thermobifida fusca, в который были дополнительно введены нуклеотиды, кодирующие последовательность His6 (His-tag) как на N-, так и на С-конце фермента (PAMO N и PAMO С соответственно). Также была получена описанная ранее PAMO L с His-tag, отделенным от С-конца дополнительным линкером KLGPEQKLISEEDLNSAVD. Все варианты PAMO экспрессировались в клетках Escherichia coli BL21(DE3) в активной форме, однако в случае PAMO N уровень экспрессии по сравнению с таковым для двух остальных форм был в 3–5 раз выше. Каталитические константы kcat PAMO С и PAMO L совпадают с литературными данными для PAMO L, полученной в другой системе экспрессии. В случае PAMO N наблюдается небольшое (на 15%) уменьшение kcat. Константы Михаэлиса по NADPH для всех форм РАМО в пределах погрешности совпадают с литературными данными для PAMO L, а KM по бензилацетону была выше в несколько раз. Кинетика термоинактивации и дифференциальная сканирующая калориметрия показали большую (в 3–4 раза) температурную стабильность PAMO N по сравнению с вариантами фермента с His-tag на С-конце.

Сноски

* Первоначально английский вариант рукописи опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM20-069, 12.05.2020.

** Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Исследование выполнено при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Правительства Москвы в рамках научного проекта № 19-34-70036. При проведении исследований использовалось оборудование Центра коллективного пользования «Геном» Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН и Центра коллективного пользования «Промышленные биотехнологии» Федерального государственного учреждения «Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” Российской академии наук».

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания выполненных авторами исследований с участием людей или использованием животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Kamerbeek, N. M., Janssen, D. B., van Berkel, W. J. H., and Fraaije, M. W. (2003) Baeyer–Villiger monooxygenases, an emerging family of flavin-dependent biocatalysts, Adv. Synth. Catal., 345, 667-678, doi: 10.1002/adsc.200303014.

2. Fraaije, M. W., Wu, J., Heuts, D. P. H. M., Van Hellemond, E. W., Spelberg, J. H. L., and Janssen, D. B. (2005) Discovery of a thermostable Baeyer–Villiger monooxygenase by genome mining, Appl. Microbiol. Biotechnol., 66, 393-400, doi: 10.1007/s00253-004-1749-5.

3. Malito, E., Alfieri, A., Fraaije, M. W., and Mattevi, A. (2004) Crystal structure of a Baeyer–Villiger monooxygenase, Proc. Natl. Acad. Sci., 101, 13157-13162, doi: 10.1073/pnas.0404538101.

4. Torres Pazmiño, D. E., Baas, B. J., Janssen, D. B., and Fraaije, M. W. (2008) Kinetic mechanism of phenylacetone monooxygenase from Thermobifida fusca, Biochemistry, 47, 4082-4093, doi: 10.1021/bi702296k.

5. Secundo, F., Fialà, S., Fraaije, M. W., De Gonzalo, G., Meli, M., Zambianchi, F., and Ottolina, G. (2011) Effects of water miscible organic solvents on the activity and conformation of the Baeyer–Villiger monooxygenases from Thermobifida fusca and Acinetobacter calcoaceticus: a comparative study, Biotechnol. Bioeng., 108, 491-499, doi: 10.1002/bit.22963.

6. Jensen, C. N., Ali, S. T., Allen, M. J., and Grogan, G. (2013) Mutations of an NAD(P)H-dependent flavoprotein monooxygenase that influence cofactor promiscuity and enantioselectivity, FEBS Open Bio, 3, 473-478, doi: 10.1016/j.fob.2013.09.008.

7. Van Bloois, E., Dudek, H. M., Duetz, W. A., and Fraaije, M. W. (2012) A stepwise approach for the reproducible optimization of PAMO expression in Escherichia coli for whole-cell biocatalysis, BMC Biotechnol., 12, 12-31, doi: 10.1186/1472-6750-12-31.

8. Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., and Pedersen, J. (2006) Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins, Protein Expr. Purif., 48, 1-13, doi: 10.1016/j.pep.2005.12.002.

9. Zhao, D., and Huang, Z. (2016) Effect of His-tag on expression, purification, and structure of zinc finger protein, ZNF191(243-368), Bioinorg. Chem. Appl., 2016, 8206854, doi: 10.1155/2016/8206854.

10. Tishkov, V. I., Pometun, A. A., Stepashkina, A. V., Fedorchuk, V. V., Zarubina, S. A., Kargov, I. S., Atroshenko, D. L., Parshin, P. D., Kovalevski, R. P., Boiko, K. M., Eldarov, M. A., D’Oronzo, E., Facheris, S., Secundo, F., and Savin, S. S. (2018) Rational design of practically important enzymes, Moscow Univ. Chem. Bull., 73, 1-6, doi: 10.3103/S0027131418020153.

11. Booth, W. T., Schlachter, C. R., Pote, S., Ussin, N., Mank, N. J., Klapper, V., Offermann, L. R., Tang, C., Hurlburt, B. K., and Chruszcz, M. (2018) Impact of an N-terminal polyhistidine tag on protein thermal stability, ACS Omega, 3, 760-768, doi: 10.1021/acsomega.7b01598.

12. Esen, H., Alpdağtaş, S., Mervan Çakar, M., and Binay, B. (2019) Tailoring of recombinant FDH: effect of histidine tag location on solubility and catalytic properties of Chaetomium thermophilum formate dehydrogenase (CtFDH), Prep. Biochem. Biotechnol., 49, 529-534, doi: 10.1080/10826068.2019.1599394.

13. Rissom, S., Schwarz-Linek, U., Vogel, M., Tishkov, V. I., and Kragl, U. (1997) Synthesis of chiral ε-lactones in a two-enzyme system of cyclohexanone monooxygenase and formate dehydrogenase with integrated bubble-free aeration, Tetrahedron Assymetry, 8, 2523-2526, doi: 10.1016/S0957-4166(97)00311-X.

14. Schwarz-Linek, U., Krödel, A., Ludwig, F.-A., Schulze, A., Rissom, S., Kragl, U., Tishkov, V. I., and Vogel, M. (2001) Synthesis of natural product precursors by Baeyer–Villiger oxidation with cyclohexanone monooxygenase from Acinetobacter, Synthesis, 33, 947-951, doi: 10.1055/s-2001-13394.

15. Тишков В. И. (1993) Структура, механизм действия и белковая инженерия NAD+-зависимой формиатдегидрогеназы, Диc. докт. xим. наук, МГУ, Моcква.

16. Tishkov, V. I., Galkin, A. G., Fedorchuk, V. V., Savitsky, P. A., Rojkova, A. M., Gieren, H., and Kula, M.-R. (1999) Pilot scale production and isolation of recombinant NAD+– and NADP+-specific formate dehydrogenase, Biotechnol. Bioeng., 64, 187-193.

17. Serov, A. E., Popova, A. S., Fedorchuk, V. V., and Tishkov, V. I. (2002) Engineering of coenzyme specificity of formate dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae, Biochem. J., 367, 841-847, doi: 10.1042/BJ20020379.

18. Пометун А. А., Паршин П. Д., Галаничева Н. П., Упоров И. В., Атрошенко Д. Л., Савин С. С., Тишков В. И. (2020) Влияние последовательности His6 на свойства формиатдегидрогеназы из бактерий Pseudomonas sp. 101, Вестник МГУ, Сер. 2: Химия, 61, 317-325.