БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 4, с. 556–566

УДК 577.151.42/45

Определение сравнительной активности ключевых ферментов эксцизионной репарации оснований в клеточных экстрактах*

© 2020 О.А. Кладова 1, Д.А. Яковлев 1, Р. Гроисман 2,3, А.А. Ищенко 2,3, М.К. Сапарбаев 2,3, О.С. Федорова 1,4**, Н.А. Кузнецов 1,4**

1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090 Новосибирск, Россия; электронная почта: fedorova@niboch.nsc.ru, nikita.kuznetsov@niboch.nsc.ru

2 Groupe “Réparation de l’AND”, Equipe Labellisée par la Ligue Nationale contre le Cancer, CNRS UMR 8200, Univ. Paris-Sud, Université Paris-Saclay, F-94805 Villejuif, France

3 Gustave Roussy, Université Paris-Saclay, F-94805 Villejuif, France

4 Новосибирский государственный университет, 630090 Новосибирск, Россия

Поступила в редакцию 21.01.2020
После доработки 13.02.2020
Принята к публикации 17.02.2020

DOI: 10.31857/S0320972520040089

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ферментативная активность, флуоресценция, ДНК-зонд, ДНК-гликозилаза, АР-эндонуклеаза.

Аннотация

Поврежденные азотистые основания ДНК удаляются в процессе эксцизионной репарации оснований. Этот ферментативный процесс начинается с действия одной из ДНК-гликозилаз, которые находят и удаляют поврежденные гетероциклические основания путем гидролиза N-гликозидных связей с образованием апуринового/апиримидинового сайта (AP-сайта). Затем апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза APE1 гидролизует фосфодиэфирную связь с 5′-стороны от АР-сайта с образованием одноцепочечного разрыва в ДНК. Снижение функциональной активности отдельных ферментов BER связано с повышенным риском развития сердечно-сосудистых, нейродегенеративных и онкологических заболеваний. В данной работе проведена разработка и апробация метода флуоресцентного анализа для измерения активности ключевых ДНК-гликозилаз и AP-эндонуклеазы человека в клеточных экстрактах. Эффективность флуоресцентных ДНК-зондов проверяли с помощью очищенных ферментов. Перспективные конструкции зондов были испытаны для определения активности ферментов в экстрактах клеточных линий A549, MCF7, HeLa, WT-7, HEK293T и HKC8. Показано, что общий уровень активности ферментов, отвечающих за репарацию АР-сайтов, удаление урацила и 5,6-дигидроурацила, был выше в линиях раковых клеток по сравнению с нормальной линией клеток почек человека HKC8.

Текст статьи

Пожалуйста, введите код, чтобы получить PDF файл с полным текстом статьи:

captcha

Сноски

* Первоначально английский вариант рукописи опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM20-017, 16.03.2020.

** Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке проекта ПФНИ ГАН (АААА-А17-117020210022-4). Часть работы, включающая апробацию ДНК-субстратов типа I и II на монофункциональных ДНК-гликозилазах MBD4 и TDG, поддержана грантом РНФ (16-14-10038). Часть работы, включающая дизайн ДНК-зондов и определение активности ферментов репарации в линиях клеток, поддержана грантом РНФ (18-14-00135). Работа также частично поддержана Ligue National Contre le Cancer «Equipe Labellisee», Electricité de France #RB 2017 (M.S.) и French National Research Agency #ANR-18-CE44-0008, и Fondation ARC #PJA-20181208015 (A.A.I.).

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая работа не содержит каких-либо исследований, в которых в качестве объектов были использованы люди или животные.

Список литературы

1. Wallace, S. S. (2002) Biological consequences of free radical-damaged DNA bases, Free Radic. Biol. Med., 33, 1-14, doi: 10.1016/s0891-5849(02)00827-4.

2. Boiteux, S., and Guillet, M. (2004) Abasic sites in DNA, repair and biological consequences in Saccharomyces cerevisiae, DNA Repair, 3, 1-12, doi: 10.1016/j.dnarep.2003.10.002.

3. Van Loon, B., Markkanen, E., and Hubscher, U. (2010) Oxygen as a friend and enemy. How to combat the mutational potential of 8-oxo-guanine, DNA Repair (Amst.), 9, 604-616, doi: 10.1016/j.dnarep.2010.03.004.

4. Kuznetsova, A. A., Knorre, D. G., and Fedorova, O. S. (2009) Oxidation of DNA and its components with reactive oxygen species, Russ. Chem. Rev., 78, 659-678, doi: 10.1070/Rc2009v078n07abeh004038.

5. Nakamura, J., Walker, V. E., Upton, P. B., Chiang, S. Y., Kow, Y. W., and Swenberg, J. A. (1998) Highly sensitive apurinic/apyrimidinic site assay can detect spontaneous and chemically induced depurination under physiological conditions, Cancer Res., 58, 222-225.

6. Frederico, L. A., Kunkel, T. A., and Shaw, B. R. (1990) A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination, determination of rate constants and the activation energy, Biochemistry (Moscow), 29, 2532-2537.

7. Burcham, P. C. (1999) Internal hazards, baseline DNA damage by endogenous products of normal metabolism, Mutat. Res., 443, 11-36.

8. Evans, M. D., Dizdaroglu, M., and Cooke, M. S. (2004) Oxidative DNA damage and disease, induction, repair and significance, Mutat. Res., 567, 1-61.

9. Leandro, G. S., Sykora, P., and Bohr, V. A. (2015) The impact of base excision DNA repair in age-related neurodegenerative diseases, Mutat. Res., 776, 31-39, doi: 10.1016/j.mrfmmm.2014.12.011.

10. Coppede, F., and Migliore, L. (2015) DNA damage in neurodegenerative diseases, Mutat. Res., 776, 84-97, doi: 10.1016/j.mrfmmm.2014.11.010.

11. Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., and Sharma, R. A. (2008) DNA repair pathways as targets for cancer therapy, Nat. Rev. Cancer, 8, 193-204, doi: 10.1038/nrc2342.

12. Dietlein, F., Thelen, L., and Reinhardt, H. C. (2014) Cancer-specific defects in DNA repair pathways as targets for personalized therapeutic approaches, Trends Genet., 30, 326-339, doi: 10.1016/j.tig.2014.06.003.

13. Trushina, E., and McMurray, C. T. (2007) Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases, Neuroscience, 145, 1233-1248, doi: 10.1016/j.neuroscience.2006.10.056.

14. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., and Lunec, J. (2003) Oxidative DNA damage, mechanisms, mutation, and disease, FASEB J., 17, 1195-1214.

15. Gros, L., Saparbaev, M. K., and Laval, J. (2002) Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage, Oncogene, 21, 8905-8925.

16. Zharkov, D. O. (2008) Base excision DNA repair, Cell. Mol. Life Sci., 65, 1544-1565, doi: 10.1007/s00018-008-7543-2.

17. Klungland, A., Rosewell, I., Hollenbach, S., Larsen, E., Daly, G., Epe, B., Seeberg, E., Lindahl, T., and Barnes, D. E. (1999) Accumulation of premutagenic DNA lesions in mice defective in removal of oxidative base damage, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 13300-13305.

18. Parsons, J. L., and Elder, R. H. (2003) DNA N-glycosylase deficient mice, a tale of redundancy, Mutat. Res., 531, 165-175.

19. Nilsen, H., Rosewell, I., Robins, P., Skjelbred, C. F., Andersen, S., Slupphaug, G., Daly, G., Krokan, H. E., Lindahl, T., and Barnes, D. E. (2000) Uracil-DNA glycosylase (UNG)-deficient mice reveal a primary role of the enzyme during DNA replication, Mol. Cell, 5, 1059-1065.

20. Fung, H., and Demple, B. (2005) A vital role for Ape1/Ref1 protein in repairing spontaneous DNA damage in human cells, Mol. Cell, 17, 463-470, doi: 10.1016/j.molcel.2004.12.029.

21. Xanthoudakis, S., Smeyne, R. J., Wallace, J. D., and Curran, T. (1996) The redox/DNA repair protein, Ref-1, is essential for early embryonic development in mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 8919-8923, doi: 10.1073/Pnas.93.17.8919.

22. Unnikrishnan, A., Raffoul, J. J., Patel, H. V., Prychitko, T. M., Anyangwe, N., Meira, L. B., Friedberg, E. C., Cabelof, D. C., and Heydari, A. R. (2009) Oxidative stress alters base excision repair pathway and increases apoptotic response in apurinic/apyrimidinic endonuclease 1/redox factor-1 haploinsufficient mice, Free Radic. Biol. Med., 46, 1488-1499, doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2009.02.021.

23. Gines, G., Saint-Pierre, C., and Gasparutto, D. (2014) On-bead fluorescent DNA nanoprobes to analyze base excision repair activities, Anal. Chim. Acta, 812, 168-175, doi: 10.1016/j.aca.2013.12.038.

24. Chaim, I. A., Nagel, Z. D., Jordan, J. J., Mazzucato, P., Ngo, L. P., and Samson, L. D. (2017) In vivo measurements of interindividual differences in DNA glycosylases and APE1 activities, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 114, 10379-10388, doi: 10.1073/pnas.1712032114.

25. Maksimenko, A., Ishchenko, A. A., Sanz, G., Laval, J., Elder, R. H., and Saparbaev, M. K. (2004) A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities, Biochem. Biophys. Res. Commun., 319, 240-246, doi: 10.1016/j.bbrc.2004.04.179.

26. Lebedeva, N. A., Anarbaev, R. O., Kupryushkin, M. S., Rechkunova, N. I., Pyshnyi, D. V., Stetsenko, D. A., and Lavrik, O. I. (2015) Design of a new fluorescent oligonucleotide-based assay for a highly specific real-time detection of apurinic/apyrimidinic site cleavage by tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1, Bioconjug. Chem., 26, 2046-2053, doi: 10.1021/acs.bioconjchem.5b00451.

27. Thomson, G. J., Hamilton, N. S., Hopkins, G. V., Waddell, I. D., Watson, A. J., and Ogilvie, D. J. (2013) A fluorescence-based assay for the apurinic/apyrimidinic-site cleavage activity of human tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1, Anal. Biochem., 440, 1-5, doi: 10.1016/j.ab.2013.05.003.

28. Li, J., Svilar, D., McClellan, S., Kim, J.-H., Ahn, E.-Y. E., Vens, C., Wilson, D. M., and Sobol, R. W. (2018) DNA repair molecular beacon assay, a platform for real-time functional analysis of cellular DNA repair capacity, Oncotarget, 9, 31719-31743, doi: 10.18632/oncotarget.25859.

29. Wilson, D. L., and Kool, E. T. (2018) Fluorescent probes of DNA repair, ACS Chem. Biol., 13, 1721-1733, doi: 10.1021/acschembio.7b00919.

30. Hu J., Liu, M.-H., Li, Y., Tang, B., and Zhang, C.-Y. (2018) Simultaneous sensitive detection of multiple DNA glycosylases from lung cancer cells at the single-molecule level, Chem. Sci., 9, 712-720, doi: 10.1039/c7sc04296e.

31. Svilar, D., Vens, C., and Sobol, R. W. (2012) Quantitative, real-time analysis of base excision repair activity in cell lysates utilizing lesion-specific molecular beacons, J. Vis. Exp., 66, 4168, doi: 10.3791/4168.

32. Healing, E., Charlier, C. F., Meira, L. B., and Elliott, R. M. (2019) A panel of colorimetric assays to measure enzymatic activity in the base excision DNA repair pathway, Nucleic Acids Res., 47, 61, doi: 10.1093/nar/gkz171.

33. Zhang, Y., Li, C., Tang, B., and Zhang, C. (2017) Homo-geneously sensitive detection of multiple dna glycosylases with intrinsically fluorescent nucleotides, Anal. Chem., 89, 7684-7692, doi: 10.1021/acs.analchem.7b01655.

34. Liu, G., He, W., and Liu, C. (2019) Sensitive detection of uracil-DNA glycosylase (UDG) activity based on terminal deoxynucleotidyl transferase-assisted formation of fluorescent copper nanoclusters (CuNCs), Talanta, 195, 320-326, doi: 10.1016/j.talanta.2018.11.083.

35. Du, Y.-C., Jiang, H.-X., Huo, Y.-F., Han, G.-M., and Kong, D.-M. (2016) Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase, Biosens. Bioelectron., 77, 971-977, doi: 10.1016/j.bios.2015.10.080.

36. Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., and Yu, R. (2012) A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity, Chem. Commun., 48, 8820-8822, doi: 10.1039/c2cc34531e.

37. Wang, L., Ren, M., Zhang, Q., Tang, B., and Zhang, C. (2017) Excision repair-initiated enzyme-assisted bicyclic cascade signal amplification for ultrasensitive detection of uracil-DNA glycosylase, Anal. Chem., 89, 4488-4494, doi: 10.1021/acs.analchem.6b04673.

38. Kladova, O. A., Bazlekowa-Karaban, M., Baconnais, S., Piétrement, O., Ishchenko, A. A., Matkarimov, B. T., Iakovlev, D. A., Vasenko, A., Fedorova, O. S., Le Cam, E., Tudek, B., Kuznetsov, N. A., and Saparbaev, M. (2018) The role of the N-terminal domain of human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1, APE1, in DNA glycosylase stimulation, DNA Repair (Amst.), 64, 10-25, doi: 10.1016/j.dnarep.2018.02.001.

39. Kuznetsova, A. A., Kuznetsov, N. A., Ishchenko, A. A., Saparbaev, M. K., and Fedorova, O. S. (2014) Pre-steady-state fluorescence analysis of damaged DNA transfer from human DNA glycosylases to AP endonuclease APE1, Biochim. Biophys. Acta, 1840, 3042-3051, doi: 10.1016/j.bbagen.2014.07.016.

40. Waters, T. R., Gallinari, P., Jiricny, J., and Swann, P. F. (1999) Human thymine DNA glycosylase binds to apurinic sites in DNA but is displaced by human apurinic endonuclease 1, J. Biol. Chem., 274, 67-74.

41. Xia, L., Zheng, L., Lee, H. W., Bates, S. E., Federico, L., Shen, B., and O’Connor, T. R. (2005) Human 3-methyladenine-DNA glycosylase, effect of sequence context on excision, association with PCNA, and stimulation by AP endonuclease, J. Mol. Biol., 346, 1259-1274, doi: 10.1016/j.jmb.2005.01.014.

42. Esadze, A., Rodriguez, G., Cravens, S. L., and Stivers, J. T. (2017) AP-endonuclease 1 accelerates turnover of human 8-oxoguanine DNA glycosylase by preventing retrograde binding to the abasic-site product, Biochemistry (Moscow), 56, 1974-1986, doi: 10.1021/acs.biochem.7b00017.

43. Baldwin, M. R., and O’Brien, P. J. (2009) Human AP endonuclease 1 stimulates multiple-turnover base excision by alkyladenine DNA glycosylase, Biochemistry, 48, 6022-6033, doi: 10.1021/bi900517y.

44. Miroshnikova, A. D., Kuznetsova, A. A., Vorobjev, Y. N., Kuznetsov, N. A., and Fedorova, O. S. (2016) Effects of mono- and divalent metal ions on DNA binding and catalysis of human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1, Mol. BioSyst., 12, 1527-1539, doi: 10.1039/c6mb00128a.

45. Kuznetsov, N. A., Koval, V. V., and Fedorova, O. S. (2011) Mechanism of recognition and repair of damaged DNA by human 8-oxoguanine DNA glycosylase hOGG1, Biochemistry (Moscow), 76, 118-130, doi: 10.1134/S0006297911010123.

46. Kladova, O. A., Kuznetsova, A. A., Fedorova, O. S., and Kuznetsov, N. A. (2017) Mutational and kinetic analysis of lesion recognition by Escherichia coli endonuclease VIII, Genes, 8, 1-13, doi: 10.3390/genes8050140.

47. Kuznetsova, A. A., Iakovlev, D. A., Misovets, I. V., Ishchenko, A. A., Saparbaev, M. K., Kuznetsov, N. A., and Fedorova, O. S. (2017) Pre-steady-state kinetic analysis of damage recognition by human single-strand selective monofunctional uracil-DNA glycosylase SMUG1, Mol. BioSyst., 13, 2638-2649, doi: 10.1039/c7mb00457e.

48. Yakovlev, D. A., Kuznetsova, A. A., Fedorova, O. S., and Kuznetsov, N. A. (2017) Search for modified DNA sites with the human methyl-CpG-binding enzyme MBD4, Acta Naturae, 9, 88-98.