БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 3, с. 378–386

УДК 577.151

Влияние структурных изменений в зоне контакта субъединиц на активность и аллостерическую регуляцию пирофосфатазы из Mycobacterium tuberculosis*

© 2020 Р.С. Романов 1,2, С.А. Курилова 1,2, А.А. Байков 1,2, Е.В. Родина 1,2**

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва, Россия; электронная почта: rodina@belozersky.msu.ru

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991 Москва, Россия

Поступила в редакцию 26.12.2019
После доработки 14.01.2020
Принята к публикации 14.01.2020

DOI: 10.31857/S0320972520030082

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: пирофосфатаза, сайт-направленный мутагенез, аллостерическая регуляция, фруктозо-1-фосфат, L-малат.

Аннотация

Гексамерная неорганическая пирофосфатаза из Mycobacterium tuberculosis (Mt-PPаза) имеет ряд структурных и функциональных особенностей, выделяющих ее среди гомологов, широко распространенных в живом мире. В частности, в ней иные контактные зоны субъединиц и отсутствует N-концевой участок полипептидной цепи. В данной работе мы сконструировали две мутантные формы фермента (Ec-Mt-РРазу и R14Q-Mt-PPазу), в первой из которых недостающая часть цепи достроена фрагментом РРазы Escherichia coli, а во второй произведена точечная замена в зоне контакта двух тримеров внутри гексамера. Обе модификации значительно улучшили каталитические свойства фермента и устранили его ингибирование избытком кофактора, иона магния. Обнаружена активация Mt-PPазы малыми (~10 мкМ) концентрациями ATP, фруктозо-1-фосфата, L-малата и негидролизуемого аналога субстрата, метиленбисфосфоната (РСР). При концентрации 100 мкМ и выше три первых соединения выступали в роли ингибиторов. Активирующее действие РСР отсутствовало у обеих мутантных форм, а ингибирующее действие фруктозо-1-фосфата отсутствовало у Ec-Mt-РРазы. Эффекты остальных модуляторов изменялись только количественно. Полученные данные свидетельствуют о наличии у Mt-РРазы аллостерических центров регуляции, которые находятся в зонах контакта субъединиц или структурно связаны с ними.

Сноски

* Первоначально английский вариант рукописи опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM19-352, 24.02.2020.

** Адресат для корреспонденции.

Благодарности

Мы благодарим П.В. Калмыкова и Н.Н. Магретову за проведение скоростной седиментации, Н.Н. Воробьеву за предоставленные образцы Ec-PPазы и М.В. Серебрякову за проведение масс-спектрометрического анализа белков. MALDI-масс-спектрометр был доступен в рамках Программы развития МГУ.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит каких-либо результатов, полученных с участием людей или животных, использованных в качестве объектов исследований.

Список литературы

1. Baykov, A.A., Cooperman, B.S., Goldman, A., and Lahti, R. (1999) Cytoplasmic inorganic pyrophosphatase, in Inorganic Polyphosphates, Springer, pp. 127–150.

2. Cooperman, B.S., Baykov, A.A., and Lahti, R. (1992) Evolutionary conservation of the active site of soluble inorganic pyrophosphatase, Trends Biochem. Sci., 17, 262–266.

3. Самыгина В.Р. (2016) Неорганические пирофосфатазы: структурная вариативность на службе функции, Успехи химии, 85, 464–476.

4. Heikinheimo, P., Tuominen, V., Ahonen, A.-K., Teplyakov, A., Cooperman, B., Baykov, A., Lahti, R., and Goldman, A. (2001) Toward a quantum-mechanical description of metal-assisted phosphoryl transfer in pyrophosphatase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 3121–3126.

5. Vijayan, M. (2005) Structural biology of mycobacterial proteins: the Bangalore effort, Tuberculosis (Edinb), 85, 357–366.

6. Rodina, E.V., Valueva, A.V., Yakovlev, R.Y., Vorobyeva, N.N., Kulakova, I.I., Lisichkin, G.V., and Leonidov, N.B. (2015) Immobilization of inorganic pyrophosphatase on nanodiamond particles retaining its high enzymatic activity, Biointerphases, 10, 041005.

7. Tammenkoski, M., Benini, S., Magretova, N.N., Baykov, A.A., and Lahti, R. (2005) An unusual, His-dependent family I pyrophosphatase from Mycobacterium tuberculosis, J. Biol. Chem., 280, 41819–41826.

8. Pratt, A.C., Dewage, S.W., Pang, A.H., Biswas, T., Barnard-Britson, S., Cisneros, G.A., and Tsodikov, O.V. (2015) Structural and computational dissection of the catalytic mechanism of the inorganic pyrophosphatase from Mycobacterium tuberculosis, J. Struct. Biol., 192, 76–87.

9. Harutyunyan, E.H., Oganessyan, V.Y., Oganessyan, N.N., Avaeva, S.M., Nazarova, T.I., Vorobyeva, N.N., Kurilova, S.A., Huber, R., and Mather, T. (1997) Crystal structure of holo inorganic pyrophosphatase from Escherichia coli at 1.9 Å resolution. Mechanism of hydrolysis, Biochemistry, 36, 7754–7760.

10. Pettersen, E.F., Goddard, T.D., Huang, C.C., Couch, G.S., Greenblatt, D.M., Meng, E.C., and Ferrin, T.E. (2004) UCSF Chimera—a visualization system for exploratory research and analysis, J. Comput. Chem., 25, 1605–1612.

11. Rodina, E.V., Vainonen, L.P., Vorobyeva, N.N., Kurilova, S.A., Sitnik, T.S., and Nazarova, T.I. (2008) Metal cofactors play a dual role in Mycobacterium tuberculosis inorganic pyrophosphatase, Biochemistry (Moscow), 73, 897–905.

12. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680.

13. Rowlands, M.G., Newbatt, Y.M., Prodromou, C., Pearl, L.H., Workman, P., and Aherne, W. (2004) High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity, Anal. Biochem., 327, 176–183.

14. Schuck, P., Gillis, R.B., Besong, T.M., Almutairi, F., Adams, G.G., Rowe, A.J., and Harding, S.E. (2014) SEDFIT– MSTAR: molecular weight and molecular weight distribution analysis of polymers by sedimentation equilibrium in the ultracentrifuge, Analyst, 139, 79–92.

15. Rodina, E.V., Vorobyeva, N.N., Kurilova, S.A., Sitnik, T.S., and Nazarova, T.I. (2007) ATP as effector of inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli. The role of residue Lys112 in binding effectors, Biochemistry (Moscow), 72, 100–108.

16. Vorobyeva, N.N., Kurilova, S.A., Anashkin, V.A., and Rodina, E.V. (2017) Inhibition of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase by fructose-1-phosphate, Biochemistry (Moscow), 82, 953–956.

17. Вайнонен Ю.П., Курилова С.А., Аваева С.М. (2002) Гексамерная, тримерная, димерная и мономерная формы неорганической пирофосфатазы Escherichia coli, Биоорганическая химия, 28, 426–433.

18. Avaeva, S.M., Rodina, E.V., Kurilova, S.A., Nazarova, T.I., Vorobyeva, N.N., Harutyunyan, E.H., and Oganessyan, V.Y. (1995) Mg2+ activation of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase, FEBS Lett., 377, 44–46.

19. Sitnik, T., Vainonen, J., Rodina, E., Nazarova, T., Kurilova, S., Vorobyeva, N., and Avaeva, S. (2003) Effectory site in Escherichia coli inorganic pyrophosphatase is revealed upon mutation at the intertrimeric interface, IUBMB Life, 55, 37–41.

20. Samygina, V.R., Moiseev, V.M., Rodina, E.V., Vorobyeva, N.N., Popov, A.N., Kurilova, S.A., Nazarova, T.I., Avaeva, S.M., and Bartunik, H.D. (2007) Reversible inhibition of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase by fluoride: trapped catalytic intermediates in cryo-crystallographic studies, J. Mol. Biol., 366, 1305–1317.

21. Avaeva, S.M., Vorobyeva, N.N., Kurilova, S.A., Nazarova, T.I., Polyakov, K.M., Rodina, E.V., and Samygina, V.R. (2000) Mechanism of Ca2+-induced inhibition of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase, Biochemistry (Moscow), 65, 373–387.

22. Vainonen, J.P., Vorobyeva, N.N., Rodina, E.V., Nazarova, T.I., Kurilova, S.A., Skoblov, J.S., and Avaeva, S.M. (2005) Metal-free PPi activates hydrolysis of MgPPi by an Escherichia coli inorganic pyrophosphatase, Biochemistry (Moscow), 70, 69–78.