БИОХИМИЯ, 2020, том 85, вып. 2, с. 287–296

УДК 577.152.51

Глутамат-рацемаза необходима для выживаемости клеток Streptococcus iniae и целостности их клеточной стенки*

© 2020 M. Мухаммад 1,2, Дж. Бай 1, A.Дж. Альхассан 3, Х. Суле 4, Дж. Цзюй 1, Б. Чжао 1**, Д. Лю 1*

College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024, China; E-mail: morui19-hebtu@qq.com, pqw1234@163.com

Department of Biochemistry, Kano University of Science and Technology, Wudil, Nigeria

Department of Biochemistry, Bayero University, Kano, Nigeria

Department of Medical Laboratory Science, Bayero University, Kano, Nigeria

Поступила в редакцию 14.06.2019
После доработки 19.09.2019
Принята к публикации 07.10.2019

DOI: 10.31857/S0320972520020128

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Streptococcus iniae, глутамат-рацемаза, нокаут гена, биохимическая характеристика целостности клеточной стенки.

Аннотация

Streptococcus iniae является патогенным и зоонозным видом бактерий, который вызывает возникновение болезней у человека и гибель многих видов рыб. Как было недавно показано у бактерий наблюдается тенденция развития устойчивости к антибиотикам, что гарантирует интерес к этой теме и требует поиска новых подходов для борьбы с возникающей инфекцией. Глутамат-рацемаза (MurI) является широко распространенным ферментом, участвующим в процессе синтеза пептидогликанов, который играет значительную роль в поддержании целостности клеточной стенки. Однако необходимость в активной глутамат-рацемазе является видоспецифичной. В настоящей работе нами был произведен нокаут гена, кодирующего глутамат-рацемазу в клетках S. iniae, и определена ее роль в поддержании целостности клеточной стенки. Кроме того, нами было осуществлено клонирование и экспрессия гена MurI, выделен и очищен его белковый продукт и определены его биохимические характеристики. Проведенный биохимический анализ показал, что ген MurI из S. iniae кодирует функционально активный фермент с молекулярной массой 30 кДа и оптимальными значениями температуры (35 °C) и pH (8,5). Ионы металлов, такие как Cu2+, Mn2+, Co2+ и Zn2+, были способны ингибировать его активность. Ген MurI крайне необходим для обеспечения жизнеспособности клеток S. iniae и целостности их клеточной стенки. Оказалось, что для достижения оптимального роста мутантного штамма S. iniae необходимо обеспечить высокую концентрацию D-глутамата. Анализ проницаемости мембран клеток мутантного штамма показал увеличение повреждения клеточной стенки во время D-глутаматного голодания. Кроме того, мутантный штамм потерял свою вирулентность при инкубации в крови рыб. Наши результаты показали, что нокаут гена MurI приводит к появлению ауксотрофного штамма S. iniae с поврежденной клеточной стенкой.

Сноски

* Приложение к статье на английском языке опубликовано на сайте журнала «Biochemistry» (Moscow) и на сайте издательства Springer (https://link.springer.com/journal/10541), том 85, вып. 2, 2020.

** Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Выполнение данной работы было поддержано Фондом естественных наук провинции Хэбэй (Natural Science Foundation of Hebei Province, грант № C2019205044), Фондом поддержки молодых ученых департамента образования провинции Хэбэй (Outstanding Youth Foundation of Department of Education of Hebei Province, грант № YQ2014026), Исследовательским фондом нормального университета провинции Хэбэй (the Research Fund of Hebei Normal University, грант № L2016Z03), Государственной центральной лабораторией изучения патогенов и биобезопасности (State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity при Академии военно-медицинской науки, грант №SKLPBS1529) и программой научно-исследовательских и технологических работ нормального университета провинции Хэбэй (the Science and Technology Research Project of Hebei Normal University, грант № ZD2018070).

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Все эксперименты над лабораторными животными были проведены в строгом соответствии с рекомендациями, изложенными в руководстве по уходу и использованию лабораторных животных провинции Хэбэй, Китай (Guide for the Care and Use of the Laboratory Animals of Hebei Province of China). Протокол экспериментов над лабораторными животными был одобрен комитетом по наблюдению за лабораторными животными нормального университета провинции Хэбэй (Animal Monitoring Committee of Hebei Normal University).

Список литературы

1. Mehboob, S., Guo, L., Fu, W., Mittal, A., Yau, T., Truong, K., Johlfs, M., Long, F., Fung, L.W.-M., and Johnson, M.E. (2009) Glutamate racemase dimerization inhibits dynamic conformational flexibility and reduces catalytic rates, Biochemistry, 48, 7045–7055, doi: 10.1021/bi9005072.

2. Rogers, H.J., Perkins, H.R., and Ward, J.B. (1980) Microbial cell walls and membranes, (Chapman and Hall), Springer, London, pp. 72-104, doi: 10.1007/978-94-011-6014-8.

3. Prosser, G.A., Rodenburg, A., Khoury, H., de Chiara, C., Howell, S., Snijders, A.P., and de Carvalho, L.P.S. (2016) Glutamate racemase is the primary target of β-chloro-D-alanine in Mycobacterium tuberculosis, Antimicrob. Agents Chemother., 60, 6091–6099, doi: 10.1128/AAC.01249-16.

4. Whalen, K.L., Pankow, K.L., Blanke, S.R., and Spies, M.A. (2009) Exploiting enzyme plasticity in virtual screening: high efficiency inhibitors of glutamate racemase, ACS Med. Chem. Lett., 1, 9–13, doi: 10.1021/ml900005b.

5. Fisher, S.L. (2008) Glutamate racemase as a target for drug discovery, Microb. Biotechnol., 1, 345–360, doi: 10.1111/j.1751-7915.2008.00031.x.

6. Dean, S.F., Whalen, K.L., and Spies, M.A. (2015) Biosynthesis of a novel glutamate racemase containing a site-specific 7-hydroxycoumarin amino acid: enzyme–li-gand promiscuity revealed at the atomistic level, ACS Cent. Sci., 1, 364–373, doi: 10.1021/acscentsci.5b00211.

7. Agnew, W., and Barnes, A.C. (2007) Streptococcus iniae: an aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination, Vet. Microbiol., 122, 1–15, doi: 10.1016/j.vetmic.2007.03.002.

8. Oh, S.-Y., Richter, S.G., Missiakas, D.M., and Schneewind, O. (2015) Glutamate racemase mutants of Bacillus anthracis, J. Bacteriol., 197, 1854–1861, doi: 10.1128/JB.00070-15.

9. Doublet, P., Van Heijenoort, J., Bohin, J.-P., and Mengin-Lecreulx, D. (1993) The murI gene of Escherichia coli is an essential gene that encodes a glutamate racemase activity, J. Bacteriol., 175, 2970–2979, doi: 10.1128/jb.175.10.2970-2979.1993.

10. Pucci, M.J., Thanassi, J.A., Ho, H.T., Falk, P.J., and Dougherty, T.J. (1995) Staphylococcus haemolyticus contains two D-glutamic acid biosynthetic activities, a glutamate racemase and a D-amino acid transaminase, J. Bacteriol., 177, 336–342, doi: 10.1128/jb.177.2.336-342.1995.

11. Fotheringham, I.G., Bledig, S.A., and Taylor, P.P. (1998) Characterization of the genes encoding D-amino acid transaminase and glutamate racemase, two D-glutamate biosynthetic enzymes of Bacillus sphaericus ATCC 10208, J. Bacteriol., 80, 4319–4323.

12. Vance, N.R., Witkin, K.R., Rooney, P.W., Li, Y., Pope, M., and Spies, M.A. (2018) Elucidating the catalytic power of glutamate racemase by investigating a series of covalent inhibitors, ChemMedChem, 13, 2514–2521, doi: 10.1002/cmdc.201800592.

13. Ferain, T., Hobbs, J., Richardson, J., Bernard, N., Garmyn, D., Hols, P., Allen, N., and Delcour, J. (1996) Knockout of the two ldh genes has a major impact on peptidoglycan precursor synthesis in Lactobacillus plantarum, J. Bacteriol., 178, 5431–5437, doi: 10.1128/jb.178.18.5431-5437.1996.

14. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H.-U., and Egli, T. (2007) Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry, Appl. Environ. Microbiol., 73, 3283–3290, doi: 10.1128/AEM.02750-06.

15. Buchanan, J.T., Colvin, K.M., Vicknair, M.R., Patel, S.K., Timmer, A.M., and Nizet, V. (2008) Strain-associated virulence factors of Streptococcus iniae in hybrid-striped bass, Vet. Microbiol., 131, 145–153, doi: 10.1016/j.vetmic.2008.02.027.

16. Hashimoto, A., Nishikawa, T., Oka, T., Takahashi, K., and Hayashi, T. (1992) Determination of free amino acid enantiomers in rat brain and serum by high-performance liquid chromatography after derivatization with N-tert.-butyl-oxycarbonyl-L-cysteine and o-phthaldialdehyde, J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl., 582, 41–48.

17. Hwang, K.Y., Cho, C.-S., Kim, S.S., Sung, H.-C., Yu, Y.G., and Cho, Y. (1999) Structure and mechanism of glutamate racemase from Aquifex pyrophilus, Nat. Struct. Mol. Biol., 6, 422, doi: 10.1038/8223.

18. Stocks, S., (2004) Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight, Cytometry A, 61, 189–195, doi: 10.1002/cyto.a.20069.

19. Liu, G.Y., Essex, A., Buchanan, J.T., Datta, V., Hoffman, H.M., Bastian, J.F., Fierer, J., and Nizet, V. (2005) Staphylococcus aureus golden pigment impairs neutrophil killing and promotes virulence through its antioxidant activity, J. Exp. Med., 202, 209–215, doi: 10.1084/jem.20050846.

20. Nakajima, N., Tanizawa, K., Tanaka, H., and Soda, K. (1986) Cloning and expression in Escherichia coli of the glutamate racemase gene from Pediococcus pentosaceus, Agric. Biol. Chem., 50, 2823–2830, doi: 10.1271/bbb1961.50.2823.

21. Böhmer, N., Dautel, A., Eisele, T., and Fischer, L. (2013) Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8, Protein Express. Purif., 88, 54–60, doi: 10.1016/j.pep.2012.11.012.

22. Dodd, D., Reese, J.G., Louer, C.R., Ballard, J.D., Spies, M.A., and Blanke, S.R. (2007) Functional comparison of the two Bacillus anthracis glutamate racemases, J. Bacteriol., 189, 5265–5275, doi: 10.1128/JB.00352-07.

23. Israyilova, A., Buroni, S., Forneris, F., Scoffone, V.C., Shixaliyev, N.Q., Riccardi, G., and Chiarelli, L.R. (2016) Biochemical characterization of glutamate racemase – a new candidate drug target against Burkholderia cenocepacia infections, PLoS One, 11, e0167350, doi: 10.1371/journal.pone.0167350.

24. Ashiuchi, M., Tani, K., Soda, K., and Misono, H. (1998) Properties of glutamate racemase from Bacillus subtilis IFO 3336 producing poly-γ-glutamate, J. Biochem., 123, 1156–1163, doi: 10.1093/oxfordjournals.jbchem.a022055.

25. Potrykus, J., Flemming, J., and Bearne, S.L. (2009) Kinetic characterization and quaternary structure of glutamate racemase from the periodontal Anaerobe Fusobacterium nucleatum, Arch. Biochem. Biophys., 491, 16–24, doi: 10.1016/j.abb.2009.09.009.

26. Sheng, X., Liu, M., Liu, H., Tang, X., Xing, J., and Zhan, W. (2018) Identification of immunogenic proteins and evaluation of recombinant PDHA1 and GAPDH as potential vaccine candidates against Streptococcus iniae infection in flounder (Paralichthys olivaceus), PLoS One, 13, e0195450, doi: 10.1371/journal.pone.0195450.

27. Kim, M.S., Choi, S.H., and Kim, K.H. (2015) Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) from Streptococcus iniae shows potential as a subunit vaccine against various Streptococcal species, J. Fish Pathol., 28, 9–15, doi: 10.7847/jfp.2015.28.1.009.

28. Muhammad, M., Li, Y., Gong, S., Shi, Y., Ju, J., Zhao, B., and Liu, D. (2019) Purification, characterization and inhibition of alanine racemase from a pathogenic strain of Streptococcus iniae, Pol. J. Microbiol., 68, 331–341, doi: 10.33073/pjm-2019-036.

29. Song, J.-H., Ko, K.S., Lee, J.-Y., Baek, J.Y., Oh, W.S., Yoon, H.S., Jeong, J.-Y., and Chun, J. (2005) Identifica-tion of essential genes in Streptococcus pneumoniae by allelic replacement mutagenesis, Mol. Cells, 19, 365–374.

30. Kimura, K., Tran, L.-S.P., and Itoh, Y. (2004) Roles and regulation of the glutamate racemase isogenes, racE and yrpC, in Bacillus subtilis, Microbiology, 150, 2911–2920, doi: 10.1099/mic.0.27045-0.

31. Li, Y., Mortuza, R., Milligan, D.L., Tran, S.L., Strych, U., Cook, G.M., and Krause, K.L. (2014) Investigation of the essentiality of glutamate racemase in Mycobacterium smegmatis, J. Bacteriol., 196, 4239–4244, doi: 10.1128/JB.02090-14.

32. Morayya, S., Awasthy, D., Yadav, R., Ambady, A., and Sharma, U. (2015) Revisiting the essentiality of glutamate racemase in Mycobacterium tuberculosis, Gene, 555, 269–276, doi: 10.1016/j.gene.2014.11.017.

33. Mortuza, R., Aung, H.L., Taiaroa, G., Opel-Reading, H.K., Kleffmann, T., Cook, G.M., and Krause, K.L. (2018) Overexpression of a newly identified d-amino acid transaminase in Mycobacterium smegmatis complements glutamate racemase deletion, Mol. Microbiol., 107, 198–213, doi: 10.1111/mmi.13877.

34. Dougherty, T.J., Thanassi, J.A., and Pucci, M.J. (1993) The Escherichia coli mutant requiring D-glutamic acid is the result of mutations in two distinct genetic loci, J. Bacteriol., 175, 111–116, doi: 10.1128/jb.175.1.111-116.1993.

35. Zhang, J., Liu, J., Ling, J., Tong, Z., Fu, Y., and Liang, M. (2016) Inactivation of glutamate racemase (MurI) eliminates virulence in Streptococcus mutans, Microbiol. Res., 186, 1–8, doi: 10.1016/j.micres.2016.02.003.

36. Malapati, P., Krishna, V.S., Nallangi, R., Meda, N., Srilakshmi, R.R., and Sriram, D. (2018) Lead identification and optimization of bacterial glutamate racemase inhibitors, Bioorg. Med. Chem., 26, 177–190, doi: 10.1016/j.bmc.2017.11.031.

37. Cabral, M.P., Garcia, P., Beceiro, A., Rumbo, C., Pérez, A., Moscoso, M., and Bou, G. (2017) Design of live attenuated bacterial vaccines based on D-glutamate auxotrophy, Nat. Commun., 8, 15480, doi: 10.1038/ncomms15480.

38. Tümmler, B. (2019) Emerging therapies against infections with Pseudomonas aeruginosa, F1000Res., 8, doi: 10.12688/f1000research.19509.1.