БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 12, с. 1876–1885

УДК 577.11

ДНК-аптамеры к экзосайту I тромбина. Структурно-функциональные взаимосвязи и антитромботические эффекты

© 2019 В.А. Спиридонова 1, Т.М. Новикова 1, В.А. Сизов 1, В.С. Шашковская 1, Е.В. Титаева 2, А.Б. Добровольский 2, Е.Б. Жарикова 2, А.В. Мазуров 2*

НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Россия

Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии, Министерство здравоохранения Российской Федерации, 121552 Москва, Россия; электронная почта: avmazurov@list.ru

Поступила в редакцию 18.04.2019
После доработки 11.07.2019
Принята к публикации 11.07.2019

DOI: 10.1134/S032097251912011X

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: аптамеры, тромбин, тромбообразование, фибриноген, фибринолиз.

Аннотация

ДНК-аптамеры (олигонуклеотиды), взаимодействующие с экзосайтом I тромбина, имеют в своем составе структуру G-квадруплекса, две Т-Т- и одну T-G-T-петли. Они препятствуют связыванию экзосайта I с фибриногеном и рецепторами тромбина на поверхности тромбоцитов и благодаря этому подавляют стимулируемые тромбином образование фибрина из фибриногена и агрегацию тромбоцитов. Ранее мы синтезировали оригинальный антитромбиновый аптамер RE31 (5′-GTGACGTAGGTTGGTGTGGTTGGGGCGTCAC-3′), содержащий (кроме G-квадруплекса) шарнирную область, соединенную с шестью парами комплементарных оснований (дуплексная область). В настоящей работе сравнивали свойства аптамера RE31 c его аналогами, содержащими разное количество оснований в дуплексной области и вставки нуклеотидов в шарнирной области. Уменьшение количества нуклеотидов в дуплексной области на 1–4 пары (по сравнению с аптамером RE31) приводило к снижению стабильности структуры аптамеров (более низкие температуры плавления) и снижению их способности ингибировать стимулированное тромбином образование фибрина в плазме крови человека в тестах тромбинового, протромбинового и активированного частичного тромбопластинового времени. В то же время увеличение количества оснований на 1–2 пары не вызывало существенных изменений стабильности и антитромбиновой активности аптамеров. Вставки в шарнирной области аптамера RЕ31 приводили к снижению антитромбиновой активности. Исследование антитромботических свойств RE31 показало, что он: 1) замедляет образование тромбина в плазме крови человека (тест генерации тромбина), 2) ускоряет растворение фибринового сгустка тканевым активатором плазминогена в модели in vitro, и 3) подавляет артериальное тромбообразование в модели in vivo. На основании полученных данных аптамер RE31 может рассматриваться как потенциально эффективное антитромботическое соединение.

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая работа не содержит каких-либо исследований, в которых в качестве объектов были использованы люди. Работу с лабораторными животными проводили в соответствии с требованиями Комиссии по биоэтике НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского. Все манипуляции выполняли в соответствии с руководством Федерации европейских научных ассоциаций по лабораторным животным.

Список литературы

1. Keefe, A.D., Pai, S., and Ellington, A. (2010) Aptamers as therapeutics, Nat. Rev. Drug Discov., 9, 537–550, doi: 10.1038/nrd3141.

2. Ni, X., Castanres, M., Mukherjee, A., and Lupoid, S.E. (2011) Nucleic acid aptamers: clinical application and promising new horizons, Curr. Med. Chem., 18, 4206–4214.

3. Li, W., Wang, K., Zhao, M., Yang, X., Chen, M., and Lan, X. (2014) Development of aptamer oligonucleotides as anticoagulants and antithrombotics for cardiovascular diseases: current status, Thromb. Res., 134, 769–773, doi: 10.1016/j.thromres.2014.05.021.

4. Crawley, J.T., Zanardelli, S., Chion, C.K., and Lane, D.A. (2007) The central role of thrombin in hemostasis, J. Thromb. Haemost., 5, 95–101, doi: 10.1111/j.1538-7836.2007.02500.x.

5. Bock, L.C., Griffin, L.C., Latham, J.A., Vermaas, E.H., and Toole, J.J. (1992) Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin, Nature, 355, 564–566, doi: 10.1038/355564a0.

6. Macaya, R.F., Schultze, P., Smith, F.W., Roe, J.A., and Feigon, J. (1993) Thrombin-binding DNA aptamer forms a unimolecular quadruplex structure in solution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 3745–3749, doi: 10.1073/pnas.90.8.3745.

7. Padmanabhan, K.P., Ferrara, J.D., Sadker, J.E., and Tulinsky, A. (1993) The structure of α-thrombin inhibited by a 15-mer single-stranded DNA aptamer, J. Biol. Chem., 268, 17651–17654, doi: 10.2210/pdb1hut/pdb.

8. Russo Krauss, I.R., Spiridonova, V., Pica, A., Napolitano, V., and Sica, F. (2016) Different duplex/quadruplex junctions determine the properties of anti-thrombin aptamers with mixed folding, Nucleic Acids Res., 44, 983–991, doi: 10.1093/nar/gkv1384.

9. Добровольский А.Б., Титаева Е.В., Хаспекова С.Г., Спиридонова В.А., Копылов А.М., Мазуров А.В. (2009) Ингибирование активности тромбина ДНК аптамерами, Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 148, 41–45.

10. Cпиридонова В.А., Головин А.В., Копылов А.М., Добровольский А.Б., Мазуров А.В. (2010) Аптамерный олигонуклеотид – прямой ингибитор тромбина. Патент РФ № 2401306, Бюлл. изобретений, 28.

11. Russo Krauss, I., Napolitano, V., Petraccone, L., Troisi, R., Spiridonova, V., Mattia, C.A., and Sica, F. (2018) Duplex/quadruplex oligonucleotides: role of the duplex domain in the stabilization of a new generation of highly effective anti-thrombin aptamers, Int. J. Biol. Macromol., 107 (Pt B), 1697–1705, doi: 10.1016/j.ijbiomac.2017.10.033.

12. Мазуров А.В., Титаева Е.В., Хаспекова С.Г., Сторожилова А.Н., Спиридонова В.А., Копылов А.М., Добровольский А.Б. (2010) Свойства нового ДНК аптамера – прямого ингибитора тромбина, Бюлл. Эксп. Биол. Мед., 150, 394–397.

13. Спиридонова В.А., Головин А.В., Копылов А.М., Добровольский А.Б., Мазуров А.В. (2011) Модифицированные ДНК аптамеры, ингибирующие активность тромбина. Патент РФ № 2410432, Бюлл. изобретений, 3.

14. Nagatoishi, S., Tanaka, Y., and Tsumoto, K. (2007) Circular dichroism spectra demonstrate formation of the thrombin-binding DNA aptamer G-quadruplex under stabilizing-cation-deficient conditions, Biochem. Biophys. Res. Commun., 352, 812–817, doi: 10.1016/j.bbrc.2006.11.088.

15. Dolinnaya, N.G., Ogloblina, A.M., and Yakubovskaya, M.G. (2016) Structure, properties, and biological relevance of the DNA and RNA G-quadruplexes: overview 50 years after their discovery, Biochemistry (Moscow), 81, 1602–1649, doi: 10.1134/S0006297916130034.

16. Mutch, N.J., Thomas, L., Moore, N.R., Lisiak, K.M., and Booth, N.A. (2007) TAFIa, PAI-1 and a2-antiplasmin: complementary roles in regulating lysis of thrombi and plasma clots, J. Thromb. Haemost., 5, 812–817, doi: 10.1111/j.1538-7836.2007.02430.x.

17. Kurz, K.D., Main, B.W., and Sandunsky, G.E. (1990) Rat model of arterial thrombosis by ferric chloride, Thromb. Res., 15, 269–280.

18. Maksimenko, A.V., Golubykh, V.L., and Tischenko, E.G. (2003) Catalase and chondroitin sulfate derivatives against thrombotic effect induced by reactive oxygen species in a rat artery. Metab. Eng., 5, 177–182.

19. Bouma, B.N., and Meijers, J.C.M. (2003) Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI, plasma procarboxypeptidase B, procarboxypeptidase R, procarboxypeptidase U), J. Thromb. Haemost., 1, 1566–1574.

20. Spiridonova, V.A., Barinova, K.V., Glinkina, K.A., Melnichuk, A.V., Gainutdynov, A.A., Safenkova, I.V., and Dzantiev, B.B. (2015) A family of DNA aptamers with varied duplex region length that forms complexes with thrombin and prothrombin, FEBS Lett., 589, 2043–2049, doi: 10.1016/j.febslet.2015.06.020.

21. Kretz, C.A., Cuddy, K.K., Stafford, A.R., Fredenburgh, J.C., Roberts, R., and Weitz, J.I. (2010) HD1, a thrombin- and prothrombin-binding DNA aptamer, inhibits thrombin generation by attenuating prothrombin activation and thrombin feedback reactions, Thromb. Haemost., 103, 83–93, doi: 10.1160/TH09-04-0237.

22. Kretz, C.A., Stafford, A.R., Fredenburgh, J.C., and Weitz, J.I. (2006) HD1, a thrombin-directed aptamer, binds exosite 1 on prothrombin with high affinity and inhibits its activation by prothrombinase, J. Biol. Chem., 281, 37477–37485, doi: 10.1074/jbc.M607359200.

23. Bukys, M.A., Orban, T., Kim, P.Y., Beck, D.O., Nesheim, M.E., and Kalafatis, M. (2006) The structural integrity of anion binding exosite I of thrombin is required and sufficient for timely cleavage and activation of factor V and factor VIII, J. Biol. Chem., 281, 18569–18580, doi: 10.1074/jbc.M600752200.

24. Petrera, N.S., Stafford, A.R., Leslie, B.A, Kretz, C.A., Fredenburgh, J.C., and Weitz, J.I. (2009) Long range communication between exosites 1 and 2 modulates thrombin function, J. Biol. Chem., 284, 25620–25629, doi: 10.1074/jbc.M109.000042.

25. Tan, X., Dey, S.K., Telmer, C, Zhang, X., Armitage, B.A., and Bruchez, M.P. (2014) Aptamers act as activators for the thrombin mediated-hydrolysis of peptide substrates, Chembiochem, 15, 205–208, doi: 10.1002/cbic.201300693.