БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 10, с. 1437–1449

УДК 577.125.54.616.832.543.51

Изменение метаболизма сфингоидных оснований в структурах головного и спинного мозга трансгенных мышей линии FUS(1-359), моделирующих боковой амиотрофический склероз *

© 2019 У.А. Гутнер 1, М.А. Шупик 1, О.А. Малошицкая 2, С.А. Соколов 2, А.П. Резвых 3, С.Ю. Фуников 3, А.Т. Лебедев 2, А.А. Устюгов 4, А.В. Алесенко 1**

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 119334 Москва, Россия; электронная почта: alicealessenko@gmail.com

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991 Москва, Россия

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарда РАН, 119991 Москва, Россия

Институт физиологически активных веществ РАН, 142432 Черноголовка, Московская обл., Россия

Поступила в редакцию 07.03.2019
После доработки 17.06.2019
Принята к публикации 17.06.2019

DOI: 10.1134/S0320972519100063

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: боковой амиотрофический склероз, сфингозин, сфингозин-1-фосфат, SPHK2, SGPP2, SGPL1, ASAH1, ASAH2.

Аннотация

Целью исследования является определение изменений в уровнях сфингоидных оснований — сфингозина (СФЗ), сфинганина и сфингозин-1-фосфата (СФЗ-1-Ф) и экспрессии генов ферментов, участвующих в их метаболизме, в структурах головного мозга (гиппокампе, коре и мозжечке) и спинного мозга трансгенных мышей линии FUS (FUS(1-359)), моделирующих боковой амиотрофический склероз (БАС). В качестве модели БАС были использованы трансгенные мыши линии FUS(1-359), характеризующиеся наличием двигательных нарушений. Липиды из структур головного и спинного мозга через 2, 3 и 4 мес развития заболевания анализировали методом хромато-масс-спектрометрии. Методом РНК-секвенирования были идентифицированы изменения в экспрессии следующих генов: SPHK1, SPHK2, SGPP2, SGPL1, ASAH1 и ASAH2. Установлено резкое повышение уровня сфингоидных оснований — СФЗ и сфинганина, обладающих резко выраженными проапоптотическими свойствами, в клетках спинного мозга на терминальной стадии развития заболевания. Отношение антиапоптотического СФЗ-1-Ф к СФЗ и сфинганину резко снижается, что указывает на интенсивное развитие апоптоза в клетках спинного мозга. Значительные нарушения в содержании СФЗ и СФЗ-1-Ф и экспрессии генов их метаболизма обнаружены на терминальной стадии развития БАС в спинном мозге. Резко активируется экспрессия СФЗ-1-Ф-лиазы и снижается экспрессия СФЗ-1-фосфатазы. Более глубокое понимание биологических путей, регулирующих метаболизм различных сфинголипидов при развитии БАС, может привести к идентификации мишеней для лекарственных препаратов нового поколения.

Сноски

* Первоначально английский вариант рукописи опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM19-067, 09.09.2019.

** Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Исследование нейродегенеративных процессов в модельных животных линии FUS(1-359) поддержано Российским научным фондом (проект № 19-13-00378). Содержание животных обеспечено программой поддержки биоресурсных коллекций ИФАВ РАН и проведено на оборудовании ЦКП ИФАВ РАН в рамках госзадания ИФАВ РАН «Поиск и исследование механизмов действия нейропротекторов и стимуляторов когнитивных функций» № 0090-2019-0005. Исследования по свойствам липидов в нейропатологиях выполнены в рамках госзадания ИБХФ РАН тема № 44.4 (Гос. Регистрации 01201253310).

Благодарности

Содержание животных обеспечено программой поддержки биоресурсных коллекций ИФАВ РАН и проведено на оборудовании ЦКП ИФАВ РАН. Анализ данных высокопроизводительного секвенирования был выполнен на оборудовании ЦКП «Геном» ИМБ РАН (http://www.eimb.ru/rus/ckp/ccu_genome_c.php).

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Список литературы

1. Van Den Bosch, L. (2011) Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis, J. Biomed. Biotechnol., 2011, 348765, doi: 10.1155/2011/348765.

2. Robberecht, W., Sapp, P., Viaene, M.K., Rosen, D., McKenna-Yasek, D., Haines, J., Horvitz, R., Theys, P., and Brown, R. Jr. (1994) Cu/Zn superoxide dismutase activity in familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis, J. Neurochem., 62, 384–387, doi: 10.1046/j.1471-4159.1994.62010384.x.

3. Koppers, M., van Blitterswijk, M.M., Vlam, L., Rowicka, P.A., van Vught, P.W., Groen, E.J., Spliet, W.G., Engelen-Lee, J., Schelhaas, H.J., de Visser, M., van der Kooi, A.J., van der Pol, W.L., Pasterkamp, R.J., Veldink, J.H., and van den Berg, L.H. (2012) VCP mutations in familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis, Neurobiol. Aging, 33, 837, doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2011.10.006.

4. Daoud, H., Suhail, H., Szuto, A., Camu, W., Salachas, F., Meininger, V., Bouchard, J.P., Dupre, N., Dion, P.A., and Rouleau, G.A. (2012) UBQLN2 mutations are rare in French and French-Canadian amyotrophic lateral sclerosis, Neurobiol. Aging, 33, 2230–2233, doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2012.03.015.

5. Sathasivam, S., Ince, P.G., and Shaw, P.J. (2001) Apoptosis in amyotrophic lateral sclerosis: a review of the evidence, Neuropathol. Appl. Neurobiol., 27, 257–274, doi: 10.1046/j.0305-1846.2001.00332.x.

6. DeJesus-Hernandez, M., Mackenzie, I.R., Boeve, B.F., Boxer, A.L., Baker, M., et al. (2011) Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS, Neuron, 72, 245–256, doi: 10.1016/j.neuron.2011.09.011.

7. Mackenzie, I.R., Bigio, E.H., Ince, P.G., Geser, F., Neumann, M., Cairns, N.J., Kwong , L.K., Forman, M.S., Ravits, J., Stewart, H., Eisen, A., McClusky, L., Kretzschmar, H.A., Monoranu, C.M., Highley, J.R., Kirby, J., Siddique, T., Shaw, P.J., Lee, V.M., and Trojanowski, J.Q. (2007) Pathological TDP-43 distinguishes sporadic amyotrophic lateral sclerosis from amyotrophic lateral sclerosis with SOD1 mutations, Ann. Neurol., 61, 427–434, doi: 10.1002/ana.21147.

8. Kwiatkowski, T.J., Bosco, D.A., Leclerc, A.L., Tamrazian, E., and Vanderburg, C.R. (2009) Mutations in the FUS/TLS gene on chromosome 16 cause familial amyotrophic lateral sclerosis, Science, 323, 1205–1208, doi: 10.1126/science.1166066.

9. Deng, H.X., Zhai, H., Bigio, E.H., Yan, J., Fecto, F., Ajroud, K., Mishra, M., Ajroud-Driss, S., Heller, S., Sufit, R., Siddique, N., Mugnaini, E., and Siddique, T. (2010) FUS-immunoreactive inclusions are a common feature in sporadic and nonSOD1 familial amyotrophic lateral sclerosis, Ann. Neurol., 67, 739–748, doi: 10.1002/ana.22051.

10. Daoud, H., Dobrzeniecka, S., Camu, W., Meininger, V., Dupre, N., Dion, P.A., and Rouleau, G.A. (2013) Mutation analysis of PFN1 in familial amyotrophic lateral sclerosis patients, Neurobiol. Aging, 34, 1311.e1–1311.e2, doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2012.09.001.

11. Munch, C., Sedlmeier, R., Meyer, T., Homberg, V., Sperfeld, A.D., Kurt, A., Prudlo, J., Peraus, G., Hanemann, C.O., Stumm, G., and Ludolph, A.C. (2004) Point mutations of the p150 subunit of dynactin (DCTN1) gene in ALS, Neurology, 63, 724–726, doi: 10.1212/01.WNL.0000134608.83927.B1.

12. Rademakers, R., and van Blitterswijk, M. (2014) Excess of rare damaging TUBA4A variants suggests cytoskeletal defects in ALS, Neuron, 84, 241–243, doi: 10.1016/j.neuron.2014.10.002.

13. Ghasemi, M., and Brown, R.H. (2017) Genetics of amyotrophic lateral sclerosis, Cold Spring Harb. Perspect. Med., 7, a024125.

14. Hussain, G., Anwar, H., Rasul, A., Imran, A., Qasim, M., Zafar, S., Imran, M., Kamran, S.K.S., Aziz, N., Razzaq, A., Ahmad, W., Shabbir, A., Iqbal, J., Baig, S.M., Ali, M., Gonzalez de Aguilar, J.L., Sun, T., Muhammad, A., and Muhammad Umair, A. (2019) Lipids as biomarkers of brain disorders, Crit. Rev. Food Sci. Nut., 7, 1–24, doi: 10.1080/10408398.2018.1529653.

15. Hussain, G., Wang, J., Rasul, A., Anwar, H., Imran, A., Qasim, M., Zafar, S., Kamran, S.K.S., Razzaq, A., Aziz, N., Ahmad, W., Shabbir, A., and Iqbal, J., (2019) Role of cholesterol and sphingolipids in brain development and neurological diseases, Lipids Health Dis., 18, 26–38, doi: 10.1186/s12944-019-0965-z.

16. Dupuis, L., Corcia, P., Fergani, A., Gonzalez De Aguilar, J.L., Bonnefont-Rousselot, D., Bittar, R., Seilhean, D., Hauw, J.J., Lacomblez, L., Loeffler, J.P., and Meininger, V. (2008) Dyslipidemia is a protective factor in amyotrophic lateral sclerosis, Neurology, 70, 1004–1009, doi: 10.1212/01.wnl.0000285080.70324.27.

17. Chen, X., Yazdani, S., Piehl, F., Magnusson, P.K.E., and Fang, F. (2018) Polygenic link between blood lipids and amyotrophic lateral sclerosis, Neurobiol. Aging, 67, 202.e1–202.e6, doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2018.03.022.

18. Albi, E., Alessenko, A., and Grosch, S. (2018), Mediators Inflamm., 2018, 1–3, doi: 10.1155/2018/7464702.

19. Алесенко А.В. (2013) Потенциальная роль сфинголипидов в нейропатогенезе болезни Альцгеймера, Биомедицинская химия, 59, 25–50, doi: 10.18097/pbmc20135901025.

20. Maceyka, M., and Spiegel, S. (2014) Sphingolipid metabolites in inflammatory disease, Nature, 510, 58–67, doi: 10.1038/nature13475.

21. Okuwa, H., Kanno, T., Fujita, Y., Gotoh, A., Tabata, C., Fukuoka, K., Nakano, T., and Nishizaki, T. (2012) Sphingosine suppresses mesothelioma cell proliferation by inhibiting PKC-δ and inducing cell cycle arrest at the G(0)/G(1) phase, Cell Physiol. Biochem., 30, 995–1004, doi: 10.1159/000341476.

22. Hannun, Y.A., Loomis, C.R., Merrill, A.H. Jr., and Bell, R.M. (1986) Sphingosine inhibition of protein kinase C activity and of phorbol dibutyrate binding in vitro and in human platelets, J. Biol. Chem., 261, 12604–12609.

23. Conkling, P.R., Patton, K.L., Hannun, Y.A., Greenberg, C.S., and Weinberg, J.B. (1989) Sphingosine inhibits monocyte tissue factor-initiated coagulation by altering factor VII binding, J. Biol. Chem., 264, 18440–18444.

24. Zhang, H., Buckley, N.E., Gibson, K., and Spiegel, S. (1990) Sphingosine stimulates cellular proliferation via a protein kinase C-independent pathway, J. Biol. Chem., 265, 76–81.

25. Hakomori, S.-I. (1992) Functional role of glycosphingolipids in tumor progression, J. Exp. Med., 168, 211–222, doi: 10.1620/tjem.168.211.

26. Bibel, D.J., Aly, R., and Shinefield, H.R. (1995) Topical sphingolipids in antisepsis and antifungal therapy, Clin. Exp. Dermatol. Clin. Exp. Dermatol., 20, 395–400.

27. Taha, T.A., Mullen, N.D., and Obeid, L.M. (2006) A house divided: ceramide, sphingosine, and sphingosine-1-phosphate in programmed cell death, Biochim. Biophys. Acta, 1758, 2027–2036.

28. Alessenko, A.V., and Khrenov, A.V. (1999) Role of sphingosine in induced apoptosis, Lipids, 34, S75–S76, doi: 10.1007/bf02562235.

29. Krown, K.A., Page, Mt., Nguyen, C., Zechner, D., Gutierrez, V., Comstock, K.L., Gembotski, C.C., Quintana, P.J., and Sabbadini, R.A. (1996) Tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis in cardiac myocytes. Involvement of the sphingolipid signaling cascade in cardiac cell death, J. Clin. Invest., 98, 2854–2865, doi: 10.1172/jci119114.

30. Sweeney, E.A., Sakakura, C., Shirahama, T., Masamune, A., Ohta, H., Hakamori, S., and Igarashi, Y. (1996) Sphingosine and its methylated derivative N,N-dimethylsphingosine (DMS) induce apoptosis in a variety of human cancer cell lines, Int. J. Cancer, 66, 358–366, doi: 10.1002/(sici)1097-0215(19960503)66:3<358::aid-ijc16>3.0.co;2-7.

31. Cuvillier, O., Nava, V.T., Murthy, S.K., Edsall, L.C., Levade, T., Milstien, S., and Spiegel, S. (2001) Sphingosine generation, cytochrome c release, and activation of caspase-7 in doxorubicin-induced apoptosis of MCF7 breast adenocarcinoma cells, Cell Death Differ., 8, 162–171, doi: 10.1038/sj.cdd.4400793.

32. Hung, W.C., Chang H.C., and Chuang, L.Y. (1999) Activation of caspase-3-like proteases in apoptosis induced by sphingosine and other long-chain bases in Hep3B hepatoma cells, Biochem. J., 338, 161–166.

33. Smith, E.R., Merrill, A.H., Obeid, L.M., and Hannun, Y.A. (2000) Effects of sphingosine and other sphingolipids on protein kinase C, Methods Enzymol., 312, 361–373, doi: 10.1016/s0076-6879(00)12921-0.

34. McDonald, O.B., Hannun, Y.A., Reynolds, C.H., and Sahyoun, N. (1991) Activation of casein kinase II by sphingosine, J. Biol. Chem., 266, 21773–21776.

35. Coroneos, E., Wang, Y., Panuska, J.R., Templeton, D.J., and Kester, M. (1996) Sphingolipid metabolites differentially regulate extracellular signal-regulated kinase and stress-activated protein kinase cascades, Biochem J., 316, 13–17, doi: 10.1042/bj3160013.

36. Megidish, T., White, T., Takio, K., Titani, K., Igarashi, Y., and Hakomori, S. (1995) The signal moleculator protein 14-3-3 is a target a sphingosine- or N,N-dimethylsphingosine-depend kinase in 3T3 (A31) cells, Biochem. Biophys. Res. Commun., 216, 739–747, doi: 10.1006/bbrc.1995.2684.

37. Pyne, S., and Pyne, N.J. (1996) The differential regulation of cyclic AMP by sphingomyelin-derived lipids and the modulation of sphingolipid-stimulated extracellular signal regulated kinase-2 in airway smooth, Biochem. J., 315, 917–923, doi: 10.1042/bj3150917.

38. Yang, S.D., Chang, H.C., and Lee, S.C. (1996) Okadaic asid, sphingosine, and phorbol ester reversibly modulate heat induction on protein kinase FA/GSK-3 alpha in A431 cells, J. Cell. Biochem., 60, 218–225, doi: 10.1002/(SICI)1097-4644(19960201)60:2<218::AID-JCB6>3.0.CO;2-#.

39. Anastasiadis, P.Z., Kuhn, D.M., Blitz, J., Imerman, B.A., Louie, M.C., and Levine, R.A. (1996) Regulation of tyrosine hydrolase and tetrahydrobiopterin biosynthetic in PC12cells by NGF, EGF and IFN-gamma, Brain Res., 713, 125–133, doi: 10.1016/0006-8993(95)01494-2.

40. Zhou, H., Summers, S.A., Birnbaum, M.J., and Pittman, R.N. (1998) Inhibition of Akt kinase by cell-permeable ceramide and its implications for ceramide-induced apoptosis, J. Biol. Chem., 273, 16568–16575, doi: 10.1074/jbc.273.26.16568.

41. Lavie, Y., and Liscovitch, M. (1990) Activation of phospholipase D by sphigoid bases in NG108-15 neural derived cells, J. Biol. Chem., 265, 3868–3872.

42. Matecki, A., Stopa, M., Was, A., and Pawelczyk, T. (1997) Effect of sphingomyelin and its metabolites on the activity of human recombinant PLC delta 1, Int. Biochem. Cell. Biol., 29, 815–828, doi: 10.1016/s1357-2725(97)00014-9.

43. Sasaki, J.I., Yamaguchi, M., Yamane, H., Okamura, N., and Ishibashi, S. (1996) Sphingosine inhibition of NADPH oxidase activation in a cell-free system, J. Biochem. (Tokio), 120, 705–709, doi: 10.1093/oxfordjournals.jbchem.a021468.

44. Pushkareva, M.Yu., Khan, W.A., Alessenko, A.V., Sahyoun, N., and Hannun, Y.A. (1992) Sphingosine activation of protein kinases in Jurkat T cells. In vitro phosphorylation of endogenous protein substrates and specificity of action, J. Biol. Chem., 267, 15246–15251.

45. Jefferson, A.B., and Schulman, H. (1988) Sphingosine inhibites calmoduline-depended enzymes, J. Biol. Chem., 263, 15241–15244.

46. Arnold, R.S., and Newton, A.C. (1991) Inhibition of the insulin receptor tyrosine kinase by sphingosine, Biochemistry, 30, 7747–7754.

47. Mullmann, T.J., Siegel, M.I., Egan, R.W., and Billah, M.M. (1991) Sphingosine inhibits phosphatidate phosphohidrolase in human neutrophils by a PKC-independed mechanism, J. Biol. Chem., 266, 2013–2016.

48. Sakane, S., Takemura, H., Yamada, K., Imoto, K., Kaneko, M., and Ohshika, H. (1996) Different effects of sphingosine, R59022 and anionic amphiphiles on two diacylglycerol kinase isozymes purified from porcine thymus cytosol, J. Biol. Chem., 271, 1148–1155, doi: 10.1016/0014-5793(89)81134-2.

49. Sohal, P.S., and Corne, R.B. (1990) Sphingosine inhibits the activity of rat liver CTP- phosphocholine cytidiltransferase, J. Biol. Chem., 265, 11746–11750.

50. Davis, R.J., Girones, N., and Faucher, M. (1988) Two alternative mechanisms control the interconversion of functional states of the epidermal growth factor receptor, J. Biol. Chem., 263, 5373–5379.

51. Fausher, M., Girones, N., Hannun, Y.A., Bell, R.M., and Davis, R.J. (1988) Regulation of the epidermal growth factor receptor phosphorylation state by sphingosine in A431 human epidermoid carcinoma cells, J. Biol. Chem., 263, 5319–5327.

52. Huang, W.C., and Chueh, S.H. (1996) Calcium mobilization from the intracellular mitochondrial and nonmitochondrial stores of the rat cerebellum, Brain Res., 718, 151–158, doi: 10.1016/0006-8993(96)00108-4.

53. Czajkowski, R., and Baranska, J. (1999) Sphingosine and phorbol ester modulate protein kinase C activity and modify ATP-evoked calcium mobilization in glioma C6 cells, Biochem. Biophys. Res. Commun., 260, 614–618, doi: 10.1006/bbrc.1999.0946.

54. Tamiya-Koizumi, K., Murate, T., Suzuki, M., Simbulan, C.M., Nakagawa, M., Takemura, M., Furuta, K., Izuta, S., and Yoshida, S. (1997) Inhibition of DNA primase by sphigosine and its analogues paralleles with their growth suppression of cultured human leukemic cells, Biochem. Mol. Biol. Int., 41, 1179–1189, doi: 10.1080/15216549700202271.

55. Koiv, A., Palvimo, J., and Kinnunen, P.K. (1995) Evidence for ternary complex formation by histone H1 and liposomes, Biochemistry, 34, 8018–8027, doi: 10.1021/bi00025a007.

56. Hwong, C.L., Chen, M.S., and Hwang, J.L. (1989) Phorbol ester transiently increases topoisomerase I mRNA levels in human skin fibroblasts, J. Biol. Chem., 264, 14923–14926.

57. Дейкин А.В., Ковражкина Е.А., Овчинников Р.К., Броновицкий Е.В., Разинская О.Д., Смирнов А.П., Ермолкевич Т.Г., Еляков А.Б., Попов А.Н., Федоров Е.Н., Лыткина О.А., Кухарский М.С., Тарасова Т.В., Шелковникова Т.А., Устюгов А.А., Нинкина Н.Н., Гольдман И.Л., Садчиков Е.Р., Бачурин С.О., Скворцова В.И. (2014) Модель бокового амиотрофического склероза на основе линии трансгенных мышей, экспрессирующих мутантную форму FUS белка человека, Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова, 8, 63–70.

58. Bligh, T.G., and Dyer, W.J. (1959) A rapid method of total lipid extraction and purification, Can. J. Biochem. Physiol., 37, 911–917, doi: 10.1139/o59-099.

59. Sullards, M.C. (2000) Analysis of sphingomyelin, glucosylceramide, ceramide, sphingosine, and sphingosine 1-phosphate by tandem mass spectrometry, Methods Enzymol., 312, 32–45, doi: 10.1016/S0076-6879(00)12898-8.

60. Funikov, S.Y., Rezvykh, A.P., Mazin, P.V., Morozov, A.V., Maltsev, A.V., Chicheva, M.M., Vikhareva, E.A., Evgen’ev, M.B., Ustyugov, A.A. (2018) FUS(1-359) transgenic mice as a model of ALS: pathophysiological and molecular aspects of the proteinopathy, Neurogenetics, 19, 189–204, doi: 10.1007/s10048-018-0553-9.

61. Krasnov, G.S., Dmitriev, A.A., Kudryavtseva, A.V., Shargunov, A.V., Karpov, D.S., Uroshlev, L.A., Melnikova, N.V., Blinov, V.M., Poverennaya, E.V., Archacov, A.I., Lisitsa, A.V., and Ponomarenko, E.A. (2015) PPLine: An automated pipeline for SNP, SAP, and splice variant detection in the context of proteogenomics, J. Proteome Res., 14, 3729–3737, doi: 10.1021/acs.jproteome.5b00490.

62. Bolger, A.M., Lohse, M., and Usadel, B. (2014) Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data, Bioinformatics, 30, 2114–2120, doi: 10.1093/bioinformatics/btu170.

63. Dobin, A., Davis, C.A., Schlesinger, F., Drenkow, J., Zaleski, C., Jha, S., Batut, P., Chaisson, M., and Gingeras, T.R. (2013) STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner, Bioinformatics, 29, 15–21, doi: 10.1093/bioinfor-matics/bts635.

64. Anders, S., Pyl, P.T., and Huber, W. (2015) HTSeq – a Python framework to work with high-throughput sequencing data, Bioinformatics, 31, 166–169, doi: 10.1101/002824.

65. Robinson, M.D., McCarthy, D.J., and Smyth, G.K. (2010) edgeR: a bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data, Bioinformatics, 26, 139–140, doi: 10.1093/bioinformatics/btp616.

66. RC Team (2000) R Language Definition, R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria.

67. Thissen, D., Steinberg, L., and Kuang, D. (2002) Quick and easy implementation of the Benjamini-Hochberg procedure for controlling the false positive rate in multiple comparisons, J. Educ. and Behav. Stat., 27, 77–83, doi: 10.3102/10769986027001077.

68. Wickham, H. (2011) ggplot2, Wiley Interdisciplinary Reviews: Computational Statistics, 3, 180–185, doi: 10.1002/wics.147.

69. Hensley, K., Floyd, R.A., Gordon, B., Mou, S., Pye, Q.N., Stewart, C., West, M., and Williamson, K. (2002) Temporal patterns of cytokine and apoptosis-related gene expression in spinal cords of the G93A-SOD1 mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J. Neurochem., 82, 365–367, doi: 10.1046/j.1471-4159.2002.00968.x.

70. Ekegren, T., Grundstrom, E., Lindholm, D., and Aquilonius, S.M. (1999) Upregulation of Bax protein and increased DNA degradation in ALS spinal cord motor neurons, Acta Neurol. Scand., 100, 317–21, doi: 10.1111/j.1600-0404.1999.tb00403.x.

71. Guegan, C., Vila, M., Rosoklija, G., Hays, A.P., and Przedborski, S. (2001) Recruitment of the mitochondrial-dependent apoptotic pathway in amyotrophic lateral sclerosis, J. Neurosci., 21, 6569–6576, doi: 10.1523/JNEUROSCI.21-17-06569.2001.

72. Berry, J.D., Paganoni, S., Atassi, N., Macklin, E.A., Goyal, N., Rivner, M., Simpson, E., Appel, S., Grasso, D.L., Mejia, N.I., Mateen, F., Gill, A., Vieira, F., Tassinari, V., and Perrin, S. (2017) Phase IIa trial of fingolimod for amyotrophic lateral sclerosis demonstrates acceptable acute safety and tolerability, Muscle Nerve, 56, 107784, doi: 10.1002/mus.25733.