БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 9, с. 1322–1334
УДК 612.089:612.014:602.9:577.113.5:575.224
Методы коррекции однонуклеотидной замены с.840С>Т в 7-м экзоне гена SMN2*
1 Федеральный исследовательский центр, Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090 Новосибирск, Россия; электронная почта: valetdinova@bionet.nsc.ru
2 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090 Новосибирск, Россия
3 Национальный медицинский исследовательский центр им. акад. Е.Н. Мешалкина Минздрава России, 630055 Новосибирск, Россия
4 Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, 630090 Новосибирск, Россия
Поступила в редакцию 30.04.2019
После доработки 03.06.2019
Принята к публикации 03.06.2019
DOI: 10.1134/S0320972519090100
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: спинальная мышечная атрофия, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, предшественники моторных нейронов, редактирование генов.
Аннотация
Технология CRISPR/Cas обладает большими перспективами в отношении лечения многих наследственных заболеваний. Среди данного типа заболеваний потенциальным кандидатом является спинальная мышечная атрофия (СМА), причина которой — делеция гена SMN1, кодирующего необходимый для «выживания» моторных нейронов белок SMN. В геноме пациентов присутствует от одной до нескольких копий гена-паралога SMN2, в 7-м экзоне которого локализована однонуклеотидная замена с.840С>Т, приводящая к нарушению сплайсинга и снижению синтеза полноразмерного белка SMN. Целью данной работы было создание и тестирование разных систем редактирования генов для коррекции однонуклеотидной замены с.840С>Т в 7-м экзоне гена SMN2 в фибробластах, индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (ИПСК) и предшественниках моторных нейронов (ПМН), полученных от пациента со спинальной мышечной атрофией. В эксперименте были использованы плазмидные векторы, обеспечивающие экспрессию компонентов системы CRISPR/Cas9 и CRISPR/Cpf1, а также плазмида и 90-звенные одноцепочечные олигонуклеотиды в качестве донорных молекул. Доставка доноров и плазмид в клетки осуществлялась методом электропорации. Показано, что при использовании протоспейсера sgRNA_Т2 в фибробластах пациента со СМА I типа система демонстрирует большую активность по сравнению с sgRNA_T1 (р < 0,05) и sgRNA_Т3 — по сравнению с sgRNA_Т1 (р < 0,05). При использовании sgRNA_Т1, sgRNA_Т2 и sgRNA_Т3 в культурах пациент-специфичных ИПСК и ПМН значимых различий в эффективности редактирования последовательности 7-го экзона гена SMN2 не обнаружено. Наибольшую эффективность в отношении коррекции замены с.840С>Т в 7-м экзоне гена SMN2 в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках и предшественниках моторных нейронов продемонстрировал вектор, экспрессирующий sgRNA_T1, и 90-звенные одноцепочечные олигонуклеотиды в качестве донорных молекул.
Текст статьи
Сноски
* Первоначально английский вариант рукописи опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM19-137, 29.07.2019.
** Адресат для корреспонденции.
Финансирование
Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 17-75-10041).
Благодарности
Авторы выражают благодарность Немудрому А.А. за помощь в сборке плазмиды pX552_miCMV_Puro_SMN.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Соблюдение этических норм
Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 года и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики. От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.
Список литературы
1. Verhaart, I.E.C., Robertson, A., Leary, R., McMacken, G., Konig, K., Kirschner, J., Jones, C.C., Cook, S.F., and Lochmuller, H. (2017) A multi-source approach to determine SMA incidence and research ready population, J. Neurol., 264, 1465–1473, doi: 10.1007/s00415-017-8549-1.
2. Lefebvre, S., Burglen, L., Reboullet, S., Clermont, O., Burlet, P., Viollet, L., Benichou, B., Cruaud, C., Millasseau, P., Zeviani, M., Le Paslier, D., Frezal, J., Cohen, D., Weissenbach, J., Munnich, A., and Melki, J. (1995) Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene, Cell, 80, 155–165, doi: 10.1016/0092-8674(95)90460-3.
3. Monani, U.R., Lorson, C.L., Parsons, D.W., Prior, T.W., Androphy, E.J., Burghes, A.H., and McPherson, J.D. (1999) A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2, Hum. Mol. Genet., 8, 1177–1183.
4. Cartegni, L., and Krainer, A.R. (2002) Disruption of an SF2/ASF-dependent exonic splicing enhancer in SMN2 causes spinal muscular atrophy in the absence of SMN1, Nat. Genet., 30, 377–384, doi: 10.1038/ng854.
5. Kashima, T., and Manley, J.L. (2003) A negative element in SMN2 exon 7 inhibits splicing in spinal muscular atrophy, Nat. Genet., 34, 460–463, doi: 10.1038/ng1207.
6. McAndrew, P.E., Parsons, D.W., Simard, L.R., Rochette, C., Ray, P.N., Mendell, J.R., Prior, T.W., and Burghes, A.H. (1997) Identification of proximal spinal muscular atrophy carriers and patients by analysis of SMNT and SMNC gene copy number, Am. J. Hum. Genet., 60, 1411–1422, doi: 10.1086/515465.
7. Gidaro, T., and Servais, L. (2019) Nusinersen treatment of spinal muscular atrophy: current knowledge and existing gaps, Dev. Med. Child Neurol., 61, 19–24, doi: 10.1111/dmcn.14027.
8. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., and Chesnut, J.D. (2017) Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA, J. Biotechnol., 241, 136–146, doi: 10.1016/j.jbiotec.2016.11.011.
9. Valetdinova, K.R., Maretina, M.A., Kuranova, M.L., Grigor’eva, E.V., Minina, Y.M., Kizilova, E.A., Kiselev, A.V., Medvedev, S.P., Baranov, V.S., and Zakian, S.M. (2019) Generation of two spinal muscular atrophy (SMA) type I patient-derived induced pluripotent stem cell (iPSC) lines and two SMA type II patient-derived iPSC lines, Stem Cell Res., 34, 101376, doi: 10.1016/j.scr.2018.101376.
10. Du, Z.W., Chen, H., Liu, H., Lu, J., Qian, K.,Huang, C. L., Zhong, X., Fan, F., and Zhang, S.C. (2015) Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells, Nat. Commun., 6, 6626, doi: 10.1038/ncomms7626.
11. Clarke, R., Heler, R., MacDougall, M.S., Yeo, N.C., Chavez, A., Regan, M., Hanakahi, L., Church, G.M., Marraffini, L.A., and Merrill, B. (2018) Enhanced bacterial immunity and mammalian genome editing via RNA-polymerase-mediated dislodging of Cas9 from double strand DNA breaks, Mol. Cell, 71, 42–55, doi: 10.1016/j.molcel.2018.06.005.
12. Brinkman, E.K., Chen, T., Amendola, M., and van Steensel, B. (2014) Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition, Nucleic Acids Res., 42, e168, doi: 10.1093/nar/gku936.
13. Ishida, K., Gee, P., and Hotta, A. (2015) Minimizing off-target mutagenesis risks caused by programmable nucleases, Int. J. Mol. Sci., 16, 24751–24771, doi: 10.3390/ijms161024751.
14. Ran, F.A., Cong, L., Yan, W.X., Scott, D.A., Gootenberg, J.S., Kriz, A.J., Zetsche, B., Shalem, O., Wu, X., Makarova, K.S., Koonin, E.V., Sharp, P.A., and Zhang, F. (2015) In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9, Nature, 520, 186–191, doi: 10.1038/nature14299.
15. Lin, Y., Cradick, T.J., Brown, M.T., Deshmukh, H., Ranjan, P., Sarode, N., Wile, B.M., Vertino, P.M., Stewart, F.J., and Bao, G. (2014) CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences, Nucleic Acids Res., 42, 7473–7485, doi: 10.1093/nar/gku402.
16. Nemudryi, A.A., Valetdinova, K.R., Medvedev, S.P., and Zakian, S.M. (2014) TALEN and CRISPR/Cas genome editing systems: tools of discovery, Acta Naturae, 6, 19–40.
17. Song, F., and Stieger, K. (2017) Optimizing the DNA donor template for homology-directed repair of double-strand breaks, Mol. Ther. Nucleic Acids, 7, 53–60, doi: 10.1016/j.omtn.2017.02.006.