Тельца включения рекомбинантного порина OmpF Yersinia pseudotuberculosis: их свойства и структурная характеристика

Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, 690022 Владивосток, Россия; электронная почта: soltaf@mail.ru

Поступила в редакцию 14.12.2018
После доработки 27.03.2019
Принята к публикации 27.03.2019

DOI: 10.1134/S0320972519060113

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Yersinia pseudotuberculosis, тельца включения, рекомбинантный порин OmpF, динамическое рассеяние света, электронная микроскопия, оптическая спектроскопия.

Аннотация

Зрелый порообразующий белок OmpF из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis экспрессировали в форме телец включения (ТВ) в Escherichia coli при разных условиях культивирования. С помощью электронной микроскопии, динамического светорассеяния, оптической спектроскопии и специфических гидрофобных красителей исследовали свойства и структурную организацию ТВ, а также структуру рекомбинантного порина (rOmpF), растворенного из них. Для ТВ определены размер, форма и стабильность в присутствии денатурантов. Показано, что ТВ хорошо растворимы в Ds-Na и более устойчивы, по сравнению с детергентом, к действию мочевины. Растворение ТВ в обоих денатурантах приводило к образованию гетерогенной по размеру популяции олигомерных частиц. Установлено, что ТВ содержат интермедиат rOmpF c выраженной вторичной структурой, близкой к нативной, и с элементами третичной структуры, который способен встраиваться в липидный бислой, приобретая функционально активную конформацию. Исследованные ТВ, которые образуются при разной концентрации индуктора (ИПТГ), заметно не различаются между собой по свойствам и структуре. Однако следует отметить, что с увеличением концентрации индуктора в ТВ возрастает содержание амилоидных структур, что может рассматриваться как неблагоприятный фактор, снижающий выход рекомбинантного белка. Полученные результаты вносят вклад в развитие новых подходов для получения активных белков из ТВ, а также ТВ, обладающих биологической и функциональной активностью.

Текст статьи

Финансирование

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (16-08-00679 и 19-03-00318).

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с использованием людей или животных в качестве объектов.

Список литературы

1. Gonzalez-Montalban, N., Natalello, A., Garcia-Fruitos, E., Villaverde, A., and Doglia, S.M. (2008) In situ protein folding and activation in bacterial inclusion bodies, Biotechnol. Bioeng., 100, 797–802, doi: 10.1002/bit.2179.

2. Gatti-Lafranconi, P., Natalello, A., Ami, D., Doglia, S.M., and Lotti, M. (2011) Concepts and tools to exploit the potential of bacterial inclusion bodies in protein science and biotechnology, FEBS J., 278, 2408–2418, doi: 10.1111/j.1742-4658.2011.08163.x.

3. Jevsevar, S., Gaberc-Porekar, V., Fonda, I., Podobnik, B., Grdadolnik, J., and Menart, V. (2005) Production of nonclassical inclusion bodies from which correctly folded protein can be extracted, Biotechnol. Prog., 21, 632–639, doi: 10.1021/bp0497839.

4. Peternel, S., Grdadolnik, J., Gaberc-Porekar, V., and Komel, R. (2008) Engineering inclusion bodies for non denaturing extraction of functional proteins, Microb. Cell Fact., 7, 34, doi: 10.1186/1475-2859-7-34.

5. Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. (2009) Неспецифические порины наружной мембраны грамотрицательных бактерий: структура и свойства, Биол. Мем., 26, 1, 6–20.

6. Galdiero, S., Falanga, A., Cantisani, M., Tarallo, R., Della Pepa, M.E., D’Oriano, V., and Galdiero, M. (2012) Microbe-host interactions: structure and role of gram-negative bacterial porins, Curr. Protein. Pept. Sci., 13, 843–854, doi: 10.2174/138920312804871120.

7. Majd, S., Yusko, E.C., Billeh, Y.N., Macrae, M.X., Yang, J., and Mayer, M. (2010) Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics, Curr. Opin. Biotechnol., 21, 439–447, doi: 10.1016/j.copbio.2010.05.002.

8. Gupta, A., Ramasubramanian Iyer, B., Chaturvedi, D., Maurya, S.R., and Mahalakshmi, R. (2015) Thermodynamic, structural and functional properties of membrane protein inclusion bodies are analogous to purified counterparts: case study from bacteria and humans, RSC Adv., 5, 1227–1234, doi: 10.1039/C4RA11207E.

9. Хоменко В.А., Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Исаева М.П., Ким Н.Ю., Лихацкая Г.Н., Вострикова О.П., Соловьева Т.Ф. (2008) Выделение и характеристика рекомбинантного OmpF-подобного порина из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis, Биоорган. химия, 34, 177–184.

10. Lugtenberg, B., Meijers, J., Peters, R., van der Hoek, P., and van Alphen, L. (1975) Electrophoretic resolution of the «major outer membrane protein» of E. coli K12 into four bands, FEBS Lett., 58, 254–258, doi: 10.1016/0014-5793(75)80272-9.

11. Бахолдина С.И., Сидорин Е.В., Хоменко В.А., Исаева М.П., Ким Н.Ю., Быстрицкая Е.П., Пименова Е.А., Соловьева Т.Ф. (2018) Влияние условий экспрессии рекомбинантной фосфолипазы А1 из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis на структуру и свойства телец включения, Биоорган. химия, 44, 163–174, doi: 10.7868/S0132342318020070.

12. Klunk, W.E., Pettegrew, J.W., and Abraham, D.J. (1989) Quantitative evaluation of Congo Red binding to amyloid-like proteins with a beta-pleated sheet conformation, J. Histochem. Cytochem., 37, 1273–1281, doi: 10.1177/37.8.2666510.

13. Provencher, S.W., and Glockner, J. (1981) Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism, Biochemistry, 20, 34–37, doi: 10.1021/bi00504a006.

14. Diwu, Z., Lu, Y., Zhang, C., Klaubert, D.H., and Haugland, R.P. (1997) Fluorescent molecular probes. II. The synthesis, spectral properties and use of fluorescent solvatochromic dapoxylm dyes, Photochem. and Photobiol., 66, 424–431, doi: 10.1111/j.1751-1097.1997.tb03168.x.

15. Faudry, E., Perdu, C., and Attree, I. (2013) in Bacterial cell surfaces: methods and protocols (Delcour A.H. ed.), Humana Press, N.Y., pp. 173–185.

16. Villa, R., Lotti, M., and Gatti-Lafranconi, P. (2009) Components of the E. coli envelope are affected by and react to protein over-production in the cytoplasm, Microb. Cell Fact., 8, 32, doi: 10.1186/1475-2859-8-32.

17. Hawe, A., Sutter, M., and Jiskoot, W. (2008) Extrinsic fluorescent dyes as tools for protein characterization, Pharmaceutical Res., 25, 7, 1487–1499, doi: 10.1007/s11095-007-9516-9.

18. Semisotnov, G.V., Rodionova, N.A., Razgulyaev, O.I., Uversky, V.N., Gripas, A.F., and Gilmanshin, R.I. (1991) Study of the «molten globule» intermediate state in protein folding by a hydrophobic fluorescent probe, Biopolymers, 31,119-128, doi: 10.1002/bip.360310111.

19. Cano-Garrido, O., Rodriguez-Carmona, E., Diez-Gil, C., Vazquez, E., Elizondo, E., Cubarsi, R., Seras-Franzoso, J., Corchero, J.L., Rinas, U., Rater, I., Ventosa, N., Veciana, J., Villaverde, A., and Garcia-Fruitos, E. (2013) Supramolecular organization of protein-releasing functional amyloids solved in bacterial inclusion bodies, Acta Biomater., 9, 4, 6134–6142, doi: 10.1016/j.actbio.2012.11.033.

20. Carrio, М.М., and Villaverde, A. (2001) Protein aggregation as bacterial inclusion bodies is reversible, FEBS Lett., 489, 1, 29–33, doi: 10.1016/S0014-5793(01)02073-7.

21. Randolph, T.W., Seefeldt, M., and Carpenter, J.F. (2002) High hydrostatic pressure as tool to study protein aggregation and amyloidosis, Biochim. Biophys. Acta, 1595, 224–234, doi: 10.1016/S0167-4838(01)00346-6.

22. Peternel, S., Jevsevar, S., Bele, M., Gaberc-Porekar, V., and Menart, V. (2008) New properties of inclusion bodies with implications for biotechnology, Biotechnol. Appl. Biochem., 49, 239–246, doi: 10.1042/BA20070140.

23. Sidorin, E.V., Khomenko, V.A., Kim, N.Y., Dmitrenok, P.S., Stenkova, A.M., Novikova, O.D., and Solov’eva, T.F. (2017) Self-organization of recombinant membrane porin OmpF from Yersinia pseudotuberculosis in aqueous environments, Biochemistry (Moscow), 82, 1304–1313, doi: 10.1134/S0006297917110086.

24. Manavalan, P., and Johnson, W.C. (1983) Sensitivity of circular dichroism to protein tertiary structure class, Nature, 305, 831–832, doi: 10.1038/305831a0.

25. Montserret, R., McLeish, M.J., Bockmann, A., Geourjon, C., and Penin, F. (2000) Involvement of electrostatic interactions in the mechanism of peptide folding induced by sodium dodecyl sulfate binding, Biochemistry, 39, 8362–8373, doi: 10.1021/bi000208x.

26. Sen, P., Fatima, S., Khan, J.M., and Khan, R.H. (2009) How methyl cyanide induces aggregation in all-alpha proteins a case study in four albumins, Intern. J. Biol. Macromol., 44, 163–169, doi: 10.1016/j.ijbiomac.2008.11.008.

27. Ioannou, J.C., Donald, A.M., and Tromp, R.H. (2015) Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer, Food Hydrocolloids, 46, 216–225, doi: 10.1016/j.foodhyd.2014.12.027.

28. Miles, A.J., and Wallace, B.A. (2016) Circular dichroism spectroscopy of membrane proteins, Chem. Soc. Rev., 45, 4859–4872, doi: 10.1039/c5cs00084j.

29. Ким Н.Ю., Новикова О.Д., Хоменко В.А., Лихацкая Г.Н., Вострикова О.П., Емельяненко В.И., Кузнецова С.М., Соловьева Т.Ф. (2007) Влияние рН на структуру и функциональную активность порина из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis. 1. Функционально значимые конформационные переходы иерсинина, Биол. мембраны, 24, 150–158.

30. Speed, M.A., Wang, D.I., and King, J. (1996) Specific aggregation of partially folded polypeptide chains: the molecular basis of inclusion body composition, Nat. Biotechnol., 14, 1283–1287, doi: 10.1038/nbt1096-1283.

31. Wurm, D.J., Quehenberger, J., Mildner, J., Eggenreich, B., Slouka, C., Schwaighofer, A., Wieland, K., Lendl, B., Rajamanickam, V., Herwig, C., and Spadiut, O. (2018) Teaching an old pET new tricks: tuning of inclusion body formation and properties by a mixed feed system in E. coli, Appl. Microbiol. Biotechnol., 102, 667–676, doi: 10.1007/s00253-017-8641-6.