Стабильные G-квадруплексы промоторов онкогенов вызывают зависимые от ионов калия остановки термостабильной ДНК-полимеразы

1 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991 Москва, Россия; электронная почта: uzhny@mail.ru

2 Московский физико-технический институт (государственный университет), 141701 Долгопрудный Московской обл., Россия

Поступила в редакцию 25.10.2018
После доработки 21.12.2018
Принята к публикации 21.12.2018

DOI: 10.1134/S0320972519050105

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ДНК, G-квадруплекс, промоторные последовательности, ПЦР, ДНК-полимераза.

Аннотация

Амплификация GC-богатых участков геномной ДНК может быть затруднена из-за высокой стабильности двойной спирали ДНК или образования альтернативных структур G-богатой нитью ДНК. Такие последовательности ДНК, потенциально способные образовывать G-квадруплексные (G4) структуры, широко распространены в промоторах генома человека. В работе исследована эффективность ПЦР-амплификации пяти промоторных последовательностей онкогенов человека (MYC, KIT, TERT, NRAS, KRAS). Показано, что эффективность ДНК-полимеразы в присутствии ионов калия значительно снижена. Методом удлинения праймера локализованы места остановок ДНК-полимеразы на 3′-концах потенциальных G4-структур. Проведен анализ структурных и термодинамических свойств коротких G-богатых олигонуклеотидов, соответствующих местам остановки ДНК-полимеразы. Показано, что олигонуклеотиды образуют параллельные G4-структуры, а также выявлена зависимость между стабильностью G4-структур и эффективностью остановки ДНК-полимеразы. Полученные результаты демонстрируют метод детекции G4-структур в протяженных геномных последовательностях, а также проясняют механизм ингибирования ДНК-полимеразы на G-богатых участках ДНК.

Текст статьи

Сноски

* Адресат для корреспонденции.

Финансирование

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 16-14-10396).

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей и использованием животных в качестве объектов исследований.

Список литературы

1. Lam, E.Y.N., Beraldi, D., Tannahill, D., and Balasubramanian, S. (2013) G-Quadruplex structures are stable and detectable in human genomic DNA, Nat. Commun., 4, 1796, doi: 10.1038/ncomms2792.

2. Todd, A.K., Johnston, M., and Neidle, S. (2005) Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA, Nucleic Acids Res., 33, 2901–2907, doi: 10.1093/nar/gki553.

3. Verma, A., Halder, K., Halder, R., Yadav, V.K., Rawal, P., Thakur, R.K., Mohd, F., Sharma, A., and Chowdhury, S. (2008) Genome-wide computational and expression analyses reveal G-quadruplex DNA motifs as conserved cis-regulatory elements in human and related species, J. Med. Chem., 51, 5641–5649, doi: 10.1021/jm800448a.

4. Bochman, M.L., Paeschke, K., and Zakian, V.A. (2012) DNA secondary structures: stability and function of G-quadruplex structures, Nat. Rev. Genet., 13, 770–780, doi: 10.1038/nrg3296.

5. Biffi, G., Tannahill, D., McCafferty, J., and Balasubramanian, S. (2013) Quantitative visualization of DNA G-quadruplex structures in human cells, Nat. Chem., 5, 182–186, doi: 10.1038/nchem.1548.

6. Biffi, G., Tannahill, D., Miller, J., Howat, W.J., and Balasubramanian, S. (2014) Elevated levels of G-quadruplex formation in human stomach and liver cancer tissues, PLoS One, 9, e102711, doi: 10.1371/journal.pone.0102711.

7. Balasubramanian, S., Hurley, L.H., and Neidle, S. (2011) Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy? Nat. Rev. Drug Discov., 10, 261–275, doi: 10.1038/nrd3428.

8. Tauchi, T., Shin-ya, K., Sashida, G., Sumi, M., Okabe, S., Ohyashiki, J.H., and Ohyashiki, K. (2006) Telomerase inhibition with a novel G-quadruplex-interactive agent, telomestatin: in vitro and in vivo studies in acute leukemia, Oncogene, 25, 5719–5725, doi: 10.1038/sj.onc.1209577.

9. Ilyinsky, N.S., Varizhuk, A.M., Beniaminov, A.D., Puza- nov, M.A., Shchyolkina, A.K., and Kaluzhny, D.N. (2014) G-quadruplex ligands: mechanisms of anticancer action and target binding, Mol. Biol., 48, 778–794, doi: 10.1134/s0026893314060077.

10. Haeusler, A.R., Donnelly, C.J., Periz, G., Simko, E.A.J., Shaw, P.G., Kim, M.-S., Maragakis, N.J., Troncoso, J.C., Pandey, A., Sattler, R., Rothstein, J.D., and Wang, J. (2014) C9orf72 nucleotide repeat structures initiate molecular cascades of disease, Nature, 507, 195–200, doi: 10.1038/nature13124.

11. Woodford, K.J., Howell, R.M., and Usdin, K. (1994) A novel K+-dependent DNA synthesis arrest site in a commonly occurring sequence motif in eukaryotes, J. Biol. Chem., 269, 27029–27035.

12. Kumari, R., Nambiar, M., Shanbagh, S., and Raghavan, S.C. (2015) Detection of G-quadruplex DNA using primer extension as a tool, PLoS One, 10, e0119722, doi: 10.1371/journal.pone.0119722.

13. Han, H., Hurley, L.H., and Salazar, M. (1999) A DNA polymerase stop assay for G-quadruplex-interactive compounds, Nucleic Acids Res., 27, 537–542.

14. Qin, Y., and Hurley, L.H. (2008) Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions, Biochimie, 90, 1149–1171, doi: 10.1016/j.biochi.2008.02.020.

15. Klenow, H., and Henningsen, I. (1969) Effect of monovalent cations on the activity of the DNA polymerase of Escherichia coli B, Eur. J. Biochem., 9, 133–141.

16. Abu Al-Soud, W., and Radstrom, P. (1998) Capacity of nine thermostable DNA polymerases to mediate DNA amplification in the presence of PCR-inhibiting samples, Appl. Environ. Microbiol., 64, 3748–3753.

17. Ramos-Aleman, F., Gonzalez-Jasso, E., and Pless, R.C. (2018) Use of alternative alkali chlorides in RT and PCR of polynucleotides containing G quadruplex structures, Anal. Biochem., 543, 43–50, doi: 10.1016/j.ab.2017.11.021.

18. Palumbo, S.L., Ebbinghaus, S.W., and Hurley, L.H. (2009) Formation of a unique end-to-end stacked pair of G-quadruplexes in the hTERT core promoter with implications for inhibition of telomerase by G-quadruplex-interactive ligands, J. Am. Chem. Soc., 131, 10878–10891, doi: 10.1021/ja902281d.

19. Chaires, J.B., Trent, J.O., Gray, R.D., Dean, W.L., Buscaglia, R., Thomas, S.D., and Miller, D.M. (2014) An improved model for the hTERT promoter quadruplex, PLoS One, 9, e115580, doi: 10.1371/journal.pone.0115580.

20. Phan, A.T., Modi, Y.S., and Patel, D.J. (2004) Propeller-type parallel-stranded G-quadruplexes in the human c-myc promoter, J. Am. Chem. Soc., 126, 8710–8716, doi: 10.1021/ja048805k.

21. Hsu, S.T., Varnai, P., Bugaut, A., Reszka, A.P., Neidle, S., and Balasubramanian, S. (2009) A G-rich sequence within the c-kit oncogene promoter forms a parallel G-quadruplex having asymmetric G-tetrad dynamics, J. Am. Chem. Soc., 131, 13399–13409, doi: 10.1021/ja904007p.

22. Cogoi, S., and Xodo, L.E. (2006) G-quadruplex formation within the promoter of the KRAS proto-oncogene and its effect on transcription, Nucleic Acids Res., 34, 2536–2549, doi: 10.1093/nar/gkl286.

23. Kumari, S., Bugaut, A., and Balasubramanian, S. (2008) Position and stability are determining factors for translation repression by an RNA G-quadruplex-forming sequence within the 5′-UTR of the NRAS proto-oncogene, Biochemistry, 47, 12664–12669, doi: 10.1021/bi8010797.