БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 4, с. 540–549
УДК 616.9:577.114:615.373
Характеристика полученного методом мини-Tn5 мутагенеза штамма Yersinia pestis, дефектного по синтезу липополисахарида*
1 ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, 142279 Оболенск, Московская обл., Россия; электронная почта: dentovskaya@obolensk.org, dentovskaya@yandex.ru
2 Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, 119991 Москва, Россия; электронная почта: knirel@ioc.ac.ru, yknirel@gmail.com
Поступила в редакцию 07.09.2018
После доработки 25.10.2018
Принята к публикации 25.10.2018
DOI: 10.1134/S0320972519040079
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Yersinia pestis, липополисахарид, биосинтез гептозы, устойчивость к сыворотке, устойчивость к антимикробным пептидам.
Аннотация
Для определения генов, продукты которых позволяют Yersinia pestis уклониться от действия антибиотиков катионно-пептидной природы, использовали стратегию ненаправленного инсерционного мутагенеза при помощи мини-транспозона Tn5 с последующим скринингом библиотеки, позволяющим обнаружить чувствительные к полимиксину Б мутанты. Для одного из них охарактеризована мутация, ответственная за полимиксин-чувствительный фенотип, и определена структура липополисахарида (ЛПС). В штамме Y. pestis KM218-А3 мини-Tn5 находился в начале открытой рамки считывания, продукт которой на 82% идентичен белку GmhB E. coli, выполняющему функцию D-глицеро-D-манно-гептозо-1,7-дифосфатфосфатазы. Масс-спектр ESI ICR FT с регистрацией анионов немодифицированного ЛПС штамма Y. pestis KM218-А3 позволил выявить молекулы с полным кором или неполным кором двух типов: один состоял только из дисахаридов Kdo-Kdo и Ko-Kdo, а другой — из трисахаридов Hep-(Kdo)-Kdo или Hep-(Ko)-Kdo. Проведенная комплементация подтвердила, что полученный дефект в биологических свойствах мутантного штамма являлся следствием инактивации гена gmhB. Продемонстрировано, что продукт гена gmhB необходим Y. pestis для образования «дикого» типа ЛПС, устойчивого к антимикробным пептидам и сыворотке крови.
Текст статьи
Сноски
* Первоначально английский вариант рукописи опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow) http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya, в рубрике «Papers in Press», BM 18-261, 28.01.2019.
** Адресат для корреспонденции.
Финансирование
Работа выполнена в рамках отраслевой научно-исследовательской программы Роспотребнадзора на 2016–2020 гг.: «Проблемно-ориентированные научные исследования в области эпидемиологического надзора за инфекционными и паразитарными болезнями».
Благодарности
Авторы благодарят Буко Линднера («Исследовательский центр Борстеля», Германия) за помощь в съемке масс-спектров.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Соблюдение этических норм
Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с использованием животных или людей в качестве объектов.
Список литературы
1. Анисимов А.П. (2002) Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных сообществ. Сообщение 1, Молекул. генетика, 3, 3–23.
2. Анисимов А.П. (2002) Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных сообществ. Сообщение 2, Молекул. генетика, 4, 3–11.
3. Portnoy, D.A. (2005) Manipulation of innate immunity by bacterial pathogens, Curr. Opin. Immunol., 17, 25–28.
4. Boman, H.G. (2002) Our endogenous peptide antibiotics keep us healthy, Lakartidningen, 99, 3424–3428.
5. Yoshio, H., Tollin, M., Gudmundsson, G.H., Lagercrantz, H., Jornvall, H., Marchini, G., and Agerberth, B. (2003) Antimicrobial polypeptides of human vernix caseosa and amniotic fluid: implications for newborn innate defense, Pediatr. Res., 53, 211–216.
6. Dimopoulos, G. (2003) Insect immunity and its implication in mosquito–malaria interactions, Cell Microbiol., 5, 3–14.
7. Anisimov, A.P., Dentovskaya, S.V., Titareva, G.M., Bakhteeva, I.V., Shaikhutdinova, R.Z., Balakhonov, S.V., Lindner, B., Kocharova, N.A., Senchenkova, S.N., Holst, O., Pier, G.B., and Knirel, Y.A. (2005) Intraspecies and temperature-dependent variation in susceptibility of Yersinia pestis to bactericidal action of serum and polymyxin B, Infect. Immun., 73, 7324–7331.
8. Rebeil, R., Ernst, R.K., Gowen, B.B., Miller, S.I., and Hinnebusch, B.J. (2004) Variation in lipid A structure pathogenic yersiniae, Mol. Microbiol., 52, 1363–1373.
9. Simon, R., Priefer, U., and Pulher, A. (1983) A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in Gram negative bacteria, Biotechnology, 1, 784–791.
10. Woodcock, D., Crowther, P., Doherty, J., Jefferson, S., DeCruz, E., Noyer-Weidner, M., Smith, S.S., Michael, M.Z., and Graham, M.W. (1989) Quantitative evaluation of Escherichia coli host strains for tolerance to cytosine methylation in plasmid and phage recombinants, Nucleic Acids Res., 17, 3469–3478.
11. Herrero, M., De Lorenzo, V., and Timmis, K.N. (1990) Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria, J. Bacteriol., 172, 6557–6567.
12. Norrander, J., Kempe, T., and Messing, J. (1983) Con-struction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis, Gene, 26, 101–106.
13. Дентовская С.В. (2012) Молекулярно-генетические механизмы образования и функциональная значимость липополисахарида Yersinia pestis. Дисc. докт. мед. наук, МНИИЭМ, Москва.
14. Ajello, L., Georg, L., Kaplan, W., and Kaufman, L. (1963) CDC Laboratory Manual for Medical Mycology, PHS Publication No. 994, U.S. Government Printing Office, Washington, D.C.
15. Maniatis, T., Fritsch, E.F., and Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York.
16. Knirel, Y.A., Lindner, B., Vinogradov, E.V., Kocharova, N.A., Senchenkova, S.N., Shaikhutdinova, R.Z., Dentovskaya, S.V., Fursova, N.K., Bakhteeva, I.V., Titareva, G.M., Balakhonov, S.V., Holst, O., Gremyakova, T.A., Pier, G.B., and Anisimov, A.P. (2005) Temperature-dependent variations and intraspecies diversity of the structure of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis, Biochemistry, 45, 1731–1743.
17. Кокушкин А.М. (1983) Трансформирующая активность плазмид чумного микроба. Дисс. канд. мед. наук, РосНИПЧИ «Микроб» Саратов.
18. Abd, H., Johansson, T., Golovliov, I., Sandstrom, G., and Forsman, M. (2003) Survival and growth of Francisella tularensis in Acanthamoeba castellanii, Appl. Environ. Microbiol., 69, 600–606.
19. Galanos, C., Luderitz, O., and Westphal, O. (1969) A new method for the extraction of R lipopolysaccharides, Eur. J. Biochem., 9, 245–249.
20. Hitchcock, P.J., and Brown, T.M. (1983) Preparation of proteinase K-treated cell lysates for SDS-PAGE, J. Bacteriol., 154, 269–277.
21. Prior, J.L., Hitchen, P.G., Williamson, E.D., Reason, A.J., Morris, H.R., Dell, A., Wren, B.W., and Titball, R.W. (2001) Characterization of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis, Microb. Pathog., 30, 49–57.
22. Tsai, C.M., and Frash, C.E. (1982) A sensitive silverstain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels, Anal. Biochem., 119, 115–119.
23. Hitchen, P.G., Prior, J.L., Oyston, P.C., Panico, M., Wren, B.W., Titball, R.W., Morris, H.R., and Dell, A. (2002) Structural characterization of lipo-oligosaccharide (LOS) from Yersinia pestis: regulation of LOS structure by the PhoPQ system, Mol. Microbiol., 44, 1637–1650.
24. Barnes, M.G., and Weiss, A.A. (2001) BrkA protein of Bordetella pertussis inhibits the classical pathway of complement after C1 deposition, Infect. Immun., 69, 3067–3072.
25. Kneidinger, B., Marolda, C., Graninger, M., Zamyatina, A., McArthur, F., Kosma, P., Valvano, M.A., and Messner, P. (2002) Biosynthesis pathway of ADP-L-glycero-beta-D-mannoheptose in Escherichia coli, J. Bacteriol., 184, 363–369.
26. Cavanaugh, D.C., and Randall, R. (1959) The role of multiplication of Pasteurella pestis in mononuclear phagocytes in the pathogenesis of fleaborne plague, J. Immunol., 83, 348–371.
27. Janssen, W.A., and Surgalla, M.J. (1969) Plague bacillus: survival within host phagocytes, Science, 163, 950–952.
28. Straley, S.C., and Harmon, P.A. (1984) Growth in mouse peritoneal macrophages of Yersinia pestis lacking established virulence determinants, Infect. Immun., 45, 649–654.
29. Charnetzky, W.T., and Shuford, W.W. (1985) Survival and growth of Yersinia pestis within macrophages and an effect of the loss of the 47-megadalton plasmid on growth in macrophages, Infect. Immun., 47, 234–241.
30. Pujol, C., Grabenstein, J.P., Perry, R.D., and Bliska, J.B. (2005) Replication of Yersinia pestis in interferon-γ-activated macrophages requires ripA, a gene encoded in the pigmentation locus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 12909–12914.
31. Bengoechea, J.A., Diaz, R., and Moriyon, I. (1996) Outer membrane differences between pathogenic and environmental Yersinia enterocolitica biogroups probed with hydrophobic permeants and polycationic peptides, Infect. Immun., 64, 4891–4899.
32. Ho, N., Kondakova, A.N., Knirel, Y.A., and Creuzenet, C. (2008) The biosynthesis and biological role of 6-deoxyheptose in the lipopolysaccharide O-antigen of Yersinia pseudotuberculosis, Mol. Microbiol., 68, 424–447.
33. Felek, S., Muszynski, A., Carlson, R.W., Tsang, T.M., Hinnebusch, B.J., and Krukonis, E.S. (2010) Phosphoglucomutase of Yersinia pestis is required for autoaggregation and polymyxin B resistance, Infect. Immun., 78, 1163–1175.
34. Aoyagi, K.L., Brooks, B.D., Bearden, S.W. Aoyagi, K.L., Brooks, B.D., Bearden, S.W., Montenieri, J.A., Gage, K.L., and Fisher, M.A. (2015) LPS modification promotes maintenance of Yersinia pestis in fleas, Microbiology, 161, 628–638.
35. Guo, J., Nair, M.K., Galvan, E.M., Liu, S.L., and Schifferli, D.M. (2011) Tn5AraOut mutagenesis for the identification of Yersinia pestis genes involved in resistance towards cationic antimicrobial peptides, Microbiol. Pathog., 51, 121–132.
36. Klein, K.A., Fukuto, H.S., Pelletier, M., Romanov, G., Grabenstein, J.P., Palmer, L.E., Ernst, R., and Bliska, J.B. (2012) A transposon site hybridization screen identifies galU and wecBC as important for survival of Yersinia pestis in murine macrophages, J. Bacteriol., 194, 653–662.
37. Rebeil, R., Ernst, R.K., Jarrett, C.O., Adams, K.N., Miller, S.I., and Hinnebusch, B.J. (2006) Characterization of late acyltransferase genes of Yersinia pestis and their role in temperature-dependent lipid A variation, J. Bacteriol., 188, 1381–1388.
38. Reines, M., Llobet E., Llompart, C.M., Moranta, D., Perez-Gutierrez, C., and Bengoechea, J.A. (2012) Molecular basis of Yersinia enterocolitica temperature-dependent resistance to antimicrobial peptides, J. Bacteriol., 194, 3173–3188.
39. Dentovskaya, S.V., Anisimov, A.P., Kondakova, A.N., Lindner, B., Bystrova, O.V., Svetoch, T.E., Shaikhutdinova, R.Z., Ivanov, S.A., Bakhteeva, I.V., Titareva, G.M., and Knirel, A.Y. (2011) Functional characterization and biological significance of Yersinia pestis lipopolysaccharide biosynthesis genes, Biochemistry (Moscow), 76, 808–822.
40. Kiljunen, S., Datta, N., Dentovskaya, S.V., Anisimov, A.P., Knirel, Y.A., Bengoechea, J.A., Holst, O., and Skurnik, M. (2011) Identification of the lipopolysaccharide core of Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis as the receptor for bacteriophage цA1122, J. Bacteriol., 193, 4963–4972.
41. Hong, W., Juneau, R.A., Pang, B., and Swords, W.E. (2009). Survival of bacterial biofilms within neutrophil extracellular traps promotes nontypeable Haemophilus influenzae persistence in the chinchilla model for otitis media, J. Innate Immun., 1, 215–224.
42. Langereis, J.D., and Weiser, J.N. (2014) Shielding of a lipooligosaccharide IgM epitope allows evasion of neutrophil mediated killing of an invasive strain of nontypeable Haemophilus influenza, mBio., 5, e01478–14, http:// doi: 10.1128/mBio.01478-14.
43. Raetz, C.R.H., and Whitfield, C. (2002) Lipopolysaccharide endotoxins, Annu. Rev. Biochem., 71, 635–700.