БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 3, с. 365–379
УДК 576.53
Клональный состав мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека: применение генетических штрих-кодов для исследования*
1 Национальный медицинский исследовательский центр гематологии Минздрава России, 125167 Москва, Россия; электронная почта: bigildeev.ae@gmail.com
2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Россия
3 НИИ физико-химической биологии МГУ им. М.В. Ломоносова, 119992 Москва, Россия
4 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, 119991 Москва, Россия
5 РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, 117997 Москва, Россия
6 Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, Россия
Поступила в редакцию 12.09.2018
После доработки 27.11.2018
Принята к публикации 27.11.2018
DOI: 10.1134/S0320972519030072
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: мультипотентные мезенхимные стромальные клетки, генетическое маркирование, штрих-код, лентивирусный вектор.
Аннотация
В работе изучали клональный состав мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) человека, маркированных с помощью лентивирусных векторов, несущих генетические штрих-коды. ММСК были инфицированы клонированной библиотекой самоинактивирующихся лентивирусных векторов, несущих 667 неповторяющихся штрих-кодов. При каждом пассировании культуры 120 клеток клонировали в 96-луночных планшетах по одной клетке на лунку. Определяли эффективность клонирования и маркирования клоногенных клеток. Из клеточных колоний-клонов выделяли ДНК и идентифицировали штрих-коды с помощью секвенирования по методу Сэнгера. Из общей популяции ММСК каждого пассажа также выделяли ДНК и определяли разнообразие, а также представленность штрих-кодов с помощью метода глубокого секвенирования на платформе Illumina. Было показано, что доля маркированных лентивирусными векторами ММСК стабильна в пассажах. Процедура маркирования при высоких значениях множественности заражения может приводить к снижению пролиферации ММСК. Анализ штрих-кодов в отдельных клеточных клонах подтвердил поликлональность популяции ММСК. При пассировании культуры ее клональный состав значительно менялся вследствие истощения пролиферативного потенциала большинства клеток. Большие клоны были обнаружены на первом пассаже ММСК, далее в популяции выявлялось множество небольших клонов с ограниченным пролиферативным потенциалом. Результаты глубокого секвенирования подтвердили данные об изменении клонального состава ММСК. В поликлональной популяции ММСК содержится лишь небольшое количество клеток с высоким пролиферативным потенциалом, среди которых могут быть и стволовые. ММСК с высоким пролиферативным потенциалом чаще выявляются на самых ранних пассажах. В связи с этим для использования ММСК в подходах регенеративной медицины, опирающихся на пролиферацию клеток, рекомендуется применять ММСК ранних пассажей.
Текст статьи
Сноски
* Приложение к статье на английском языке опубликовано на сайте журнала «Biochemistry» (Moscow) и на сайте издательства Springer (link.springer.com), том 84, вып. 3, 2019.
** Адресат для корреспонденции.
Благодарности
Авторы благодарят проф. Б. Фезе и К. Корнилс (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Гамбург, Германия) за предоставленную библиотеку плазмид, содержащих штрих-коды, и линию-продуцент для получения лентивирусного вектора.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Соблюдение этических норм
Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального комитета по исследовательской этике и Хельсинской декларации 1964 года и ее последующим изменениям и сопоставимым нормам этики. От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.
Список литературы
1. Friedenstein, A.J., Chailakhjan, R.K., and Lalykina, K.S. (1970) The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells, Cell Tissue Kinet., 3, 393–403, doi: 10.1111/j.1365-2184.1970.tb00347.
2. Caplan, A.I. (1991) Mesenchymal stem cells, J. Orthop. Res., 9, 641–650, doi: 10.1002/jor.1100090504.
3. Horwitz, E.M., Le Blanc, K., Dominici, M., Mueller, I., Slaper-Cortenbach, I., Marini, F.C., Deans, R.J., Krause, D.S., Keating, A., and International Society for Cellular Therapy. (2005) Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement, Cytotherapy, 7, 393–395, doi: 10.1080/14653240500319234.
4. Dominici, M., Le Blanc, K., Mueller, I., Slaper-Cortenbach, I., Marini, F., Krause, D., Deans, R., Keating, A., Prockop, Dj., and Horwitz, E. (2006) Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement, Cytotherapy, 8, 315–317, doi: 10.1080/14653240600855905.
5. Jones, B.J. and McTaggart, S.J. (2008) Immunosup-pression by mesenchymal stromal cells: from culture to clinic, Exp. Hematol., 36, 733–741, doi: 10.1016/j.exphem.2008.03.006.
6. Spees, J.L., Lee, R.H., and Gregory, C.A. (2016) Mechanisms of mesenchymal stem/stromal cell function, Stem Cell Res. Ther., 7, 125, doi: 10.1186/s13287-016-0363-7.
7. Pittenger, M.F., Mackay, A.M., Beck, S.C., Jaiswal, R.K., Douglas, R., Mosca, J.D., Moorman, M.A., Simonetti, D.W., Craig, S., and Marshak, D.R. (1999) Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells, Science, 284, 143–147, doi: 10.1126/science.284.5411.143.
8. Palau, P., Dominguez, E., Lopez, L., Heredia, R., Gonzalez, J., Ramon, J.M., Serra, P., Santas, E., Bodi, V., Sanchis, J., Chorro, F.J., and Nunez, J. (2016) Inspiratory muscle training and functional electrical stimulation for treatment of heart failure with preserved ejection fraction: rationale and study design of a prospective randomized controlled trial, Clin. Cardiol., 39, 433–439, doi: 10.1002/clc.22555.
9. Russell, K.C., Phinney, D.G., Lacey, M.R., Barrilleaux, B.L., Meyertholen, K.E., and O’Connor, K.C. (2010) In vitro high-capacity assay to quantify the clonal heterogeneity in trilineage potential of mesenchymal stem cells reveals a complex hierarchy of lineage commitment, Stem Cells, 28, 788–798, doi: 10.1002/stem.312.
10. Bigildeev, A.E., Zhironkina, O.A., Shipounova, I.N., Sats, N.V, Kotyashova, S.Y., and Drize, N.J. (2012) Clonal composition of human multipotent mesenchymal stromal cells, Exp. Hematol., 40, 847–856, doi: 10.1016/j.exphem.2012.06.006.
11. Gerrits, A., Dykstra, B., Kalmykowa, O.J., Klauke, K., Verovskaya, E., Broekhuis, M.J.C., de Haan, G., and Bystrykh, L.V. (2010) Cellular barcoding tool for clonal analysis in the hematopoietic system, Blood, 115, 2610–2618, doi: 10.1182/blood-2009-06-229757.
12. Bystrykh, L.V., and Belderbos, M.E. (2016) Clonal analysis of cells with cellular barcoding: when numbers and sizes matter, Methods Mol. Biol., 1516, 57–89, doi: 10.1007/7651_2016_343.
13. Ребриков Д.В., Коростин Д.О., Шубина Е.С., Ильинский В.В. (2015) NGS: высокопроизводительное секвенирование, Москва, Лаборатория знаний.
14. Glimm, H., Ball, C.R., and von Kalle, C. (2011) You can count on this: barcoded hematopoietic stem cells, Cell Stem Cell, 9, 390–392, doi: https://doi.org/10.1016/j.stem.2011.10.013.
15. Maetzig, T., Brugman, M.H., Bartels, S., Heinz, N., Kustikova, O.S., Modlich, U., Li, Z., Galla, M., Schiedlmeier, B., Schambach, A., and Baum, C. (2011) Polyclonal fluctuation of lentiviral vector-transduced and expanded murine hematopoietic stem cells, Blood, 117, 3053–3064, doi: 10.1182/blood-2010-08-303222.
16. Lu, R., Neff, N.F., Quake, S.R., and Weissman, I.L. (2011) Tracking single hematopoietic stem cells in vivo using high-throughput sequencing in conjunction with viral genetic barcoding, Nat. Biotechnol., 29, 928–933, doi: 10.1038/nbt.1977.
17. Verovskaya, E., Broekhuis, M.J.C., Zwart, E., Ritsema, M., van Os, R., de Haan, G., and Bystrykh, L.V. (2013) Heterogeneity of young and aged murine hematopoietic stem cells revealed by quantitative clonal analysis using cellular barcoding, Blood, 122, 523–532, doi: 10.1182/blood-2013-01-481135.
18. Biasco, L., Pellin, D., Scala, S., Dionisio, F., Basso-Ricci, L., Leonardelli, L., Scaramuzza, S., Baricordi, C., Ferrua, F., Cicalese, M.P., Giannelli, S., Neduva, V., Dow, D.J., Schmidt, M., Von Kalle, C., Roncarolo, M.G., Ciceri, F., Vicard, P., Wit, E., Di Serio, C., Naldini, L., and Aiuti, A. (2016) In vivo tracking of human hematopoiesis reveals patterns of clonal dynamics during early and steady-state reconstitution phases, Cell Stem Cell, 19, 107–119, doi: 10.1016/j.stem.2016.04.016.
19. Nguyen, L.V, Pellacani, D., Lefort, S., Kannan, N., Osako, T., Makarem, M., Cox, C.L., Kennedy, W., Beer, P., Carles, A., Moksa, M., Bilenky, M., Balani, S., Babovic, S., Sun, I., Rosin, M., Aparicio, S., Hirst, M., and Eaves, C.J. (2015) Barcoding reveals complex clonal dynamics of de novo transformed human mammary cells, Nature, 528, 267–271, doi: 10.1038/nature15742.
20. Cornils, K., Thielecke, L., Huser, S., Forgber, M., Thomaschewski, M., Kleist, N., Hussein, K., Riecken, K., Volz, T., Gerdes, S., Glauche, I., Dahl, A., Dandri, M., Roeder, I., and Fehse, B. (2014) Multiplexing clonality: combining RGB marking and genetic barcoding, Nucleic Acids Res., 42, e56, doi: 10.1093/nar/gku081.
21. Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., and Fehse, B. (2008) A multicolor panel of novel lentiviral «gene ontology» (LeGO) vectors for functional gene analysis, Mol. Ther., 16, 698–706, doi: 10.1038/mt.2008.6.
22. Aranyossy, T., Thielecke, L., Glauche, I., Fehse, B., and Cornils, K. (2017) Genetic barcodes facilitate competitive clonal analyses in vivo, Hum. Gene Ther., 28, 926–937, doi: 10.1089/hum.2017.124.
23. Sambrook, J., Fritsch, E., and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.
24. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J., Smith, J.A., and Struhl, K. (1991) Current protocols in molecular biology, New York, John Wiley & Sons, Inc.
25. Kuzmina, L.A., Petinati, N.A., Parovichnikova, E.N., Lubimova, L.S., Gribanova, E.O., Gaponova, T.V, Shipounova, I.N., Zhironkina, O.A., Bigildeev, A.E., Svinareva, D.A., Drize, N.J., and Savchenko, V.G. (2012) Multipotent mesenchymal stromal cells for the prophylaxis of acute graft-versus-host disease-a phase II study, Stem Cells Int., 2012, 1–8, doi: 10.1155/2012/968213.
26. Todoerti, K., Lisignoli, G., Storti, P., Agnelli, L., Novara, F., Manferdini, C., Codeluppi, K., Colla, S., Crugnola, M., Abeltino, M., Bolzoni, M., Sgobba, V., Facchini, A., Lambertenghi-Deliliers, G., Zuffardi, O., Rizzoli, V., Neri, A., and Giuliani, N. (2010) Distinct transcriptional profiles characterize bone microenvironment mesenchymal cells rather than osteoblasts in relationship with multiple myeloma bone disease, Exp. Hematol., 38, 141–153, doi: 10.1016/j.exphem.2009.11.009.
27. Gasparian, M.E., Elistratov, P.A., Drize, N.I., Nifontova, I.N., Dolgikh, D.A., and Kirpichnikov, M.P. (2009) Overexpression in Escherichia coli and purification of human fibroblast growth factor (FGF-2), Biochemistry (Moscow), 74, 221–225, doi: 10.1134/S000629790902014X.
28. Bailey, N.T.J. (1995) Statistical methods in biology, 3rd edition, Cambridge, Cambridge University Press.
29. Жиронкина О.А., Шипунова И.Н., Бигильдеев А.Е., Сац Н.В., Петинати Н.А., Дризе Н.И. (2011) Пролиферативный потенциал мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из костного мозга человека, Клеточные технол. биол. мед., 230–235.